养殖鲈鲤致病性类志贺邻单胞菌的分离与鉴定
发布时间：2020-08-26 18:09
【摘要】：本文以分离自患病养殖鲈鲤的类志贺邻单胞菌为研究对象。自发病鲈鲤体内明显病灶处分离后,选择优势菌纯化保存待用。利用常规生理生化、分子生物学和API微生物系统对其分类学地位进行综合鉴定,对主要受损器官肝脏和肠道开展病理学研究,并进行攻毒感染验证性试验,同时进行常用抗生素药物的筛选,为发病鲈鲤的病因及防治提供科学依据。主要研究结果如下:1.分离和初步鉴定。对批次患病鲈鲤的细菌性疾病病原菌进行研究:自濒死鲈鲤个体肝脏及肾脏等部位分离得到菌株后经纯培养得到一株致病菌(编号为LLS1);以攻毒感染实验结果判定为致病菌;经革兰氏染色、葡萄糖发酵及氧化酶等生理生化反应,初步认定菌株为革兰氏阴性杆菌,葡萄糖发酵反应产酸不产气,氧化酶实验反应为阳性。2.API微生物鉴定系统。采用法国API自动微生物鉴定系统对分离纯化致病菌株进行鉴定,以嗜水气单胞菌的标准菌株为质控菌。结果显示:对质控嗜水气单胞菌的标准菌株ATCC7966以及分离致病菌株LLS1的鉴定结果均有较高的可信度,其鉴定值均大于99%(分别为99.80%、99.90%),符合率分别为0.64和0.72(T≥0.50)。ATCC7966标准菌株的鉴定结果为嗜水气单胞菌,LLS1菌株的鉴定结果为类志贺邻单胞菌。3.分子生物学分析。采用16S rRNA、23S rRNA和gyrB三个基因的序列,综合对分离菌株进行分类地位的鉴定。通过引物设计与PCR扩增,最终获得的分子序列以构建NJ分子进化树,结果显示16S rRNA、23S rRNA和gyrB各基因片段所扩增出的片段长度分别为1400bp、280bp、1100bp的条带,其大小与目标条带预期大小相符;进化树分析显示各基因均与类志贺邻单胞菌聚为一支,并有较高的置信度。4.组织病理学。以攻毒感染实验中具有典型病症的濒死鲈鲤为研究对象,解剖获取肝脏和肠道组织,固定后经组织切片处理。肝脏组织病理学观察结果主要症状:炎性细胞呈现灶性聚集,聚集处附近细胞结构不清晰,边界模糊;细胞变性坏死,细胞核核质浓缩、核膜边缘不规则收缩,部分肝细胞呈空泡样、细胞核溶解消失;组织疏松、水肿;血窦周围有细胞变性坏死;组织结构被破坏。肠道组织病理学观察结果主要有:肠绒毛内壁出血;绒毛上皮缺失;绒毛内充血;绒毛处有明显空泡样;炎症表现,有绒毛脱落破碎化分布。5.药敏试验。本研究利用K-B纸片扩散法检测患病鲈鲤中分离的类志贺邻单胞菌株对17种常见抗生素类药物的敏感性。结果表明分离类志贺邻单胞菌菌株对强力霉素、庆大霉素、先锋霉素V、氯霉素等4种药物呈现敏感反应;对环丙氟哌酸、氟哌酸、红霉素等3种药物呈中度敏感反应;对四环素、链霉素、恩诺沙星、氨苄西林、哌拉西林、青霉素、磺胺异VA唑、氟苯尼考、利福平、万古霉素等10种药物具有抗性。
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943
【图文】：
图 2-1 分离菌株 LLS1 在 SS（a）、普通营养琼脂（b）培养基中生长特征Fig.2-1 Isolated strain LLS1 on SS（a）、General nutrition agar（b）患病个体症状主要表现为前期：出现轻度浮头及离群游动，游动缓慢，摄食减少；中期：完全停止进食，眼球轻微突出，下颌以及腹部轻微出血，鳍条发红；后期：陆续出现死亡现象，腹部出血及膨胀现象。解剖后观察发现死亡鱼体腹腔内都不同程度的出现少许积液（即腹水）；肝脏肿大，颜色淡黄且有不规则分布的红点分布其上，用解剖针插入，感觉组织轻微松脆似豆沙状；鳃部轻者炎症，重者出现糜烂及烂鳃并伴有腮部出血的症状。
图 2-2 患病鲈鲤的症状a 患病致死鲈鲤；b 腹部出血；c 鳃部霉变；d 烂鳃及鳃部出血 2-2 Onset symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death Percocyprishang） b. abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills and gills b离菌株的生化鉴定初步结果糖发酵及氧化酶结果显示（见图 2-3），分离菌株为发酵型（葡萄糖果为产酸不产气），氧化酶实验（即细胞色素氧化酶）反应为阳性（
图 2-2 患病鲈鲤的症状病致死鲈鲤；b 腹部出血；c 鳃部霉变；d 烂鳃及鳃部 symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death P abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills a生化鉴定初步结果氧化酶结果显示（见图 2-3），分离菌株为发酵型不产气），氧化酶实验（即细胞色素氧化酶）反应
【学位授予单位】：贵州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943
【图文】：
图 2-1 分离菌株 LLS1 在 SS（a）、普通营养琼脂（b）培养基中生长特征Fig.2-1 Isolated strain LLS1 on SS（a）、General nutrition agar（b）患病个体症状主要表现为前期：出现轻度浮头及离群游动，游动缓慢，摄食减少；中期：完全停止进食，眼球轻微突出，下颌以及腹部轻微出血，鳍条发红；后期：陆续出现死亡现象，腹部出血及膨胀现象。解剖后观察发现死亡鱼体腹腔内都不同程度的出现少许积液（即腹水）；肝脏肿大，颜色淡黄且有不规则分布的红点分布其上，用解剖针插入，感觉组织轻微松脆似豆沙状；鳃部轻者炎症，重者出现糜烂及烂鳃并伴有腮部出血的症状。
图 2-2 患病鲈鲤的症状a 患病致死鲈鲤；b 腹部出血；c 鳃部霉变；d 烂鳃及鳃部出血 2-2 Onset symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death Percocyprishang） b. abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills and gills b离菌株的生化鉴定初步结果糖发酵及氧化酶结果显示（见图 2-3），分离菌株为发酵型（葡萄糖果为产酸不产气），氧化酶实验（即细胞色素氧化酶）反应为阳性（
图 2-2 患病鲈鲤的症状病致死鲈鲤；b 腹部出血；c 鳃部霉变；d 烂鳃及鳃部 symptoms of Percocypris pingi pingi（Tchang） a.death P abdominal hemorrhage c. gill grows mildew d. rotten gills a生化鉴定初步结果氧化酶结果显示（见图 2-3），分离菌株为发酵型不产气），氧化酶实验（即细胞色素氧化酶）反应
【参考文献】
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6 岳兴建;史晋绒;王永明;李斌;邹远超;覃川杰;谢碧文;王m
本文编号：2805519
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