溶藻弧菌细胞密度相关型sRNA的鉴定及功能研究

发布时间：2020-09-03 11:09

　　 溶藻弧菌是一种革兰氏阴性细菌,属于弧菌属,广泛存在于湖泊和海水中,可以导致鱼类的溃疡病,严重者导致死亡,是我国水产养殖业重要的病原菌。此外,还可通过受染海产品食用等方式危害人类健康,引发食品安全问题。目前已鉴定的溶藻弧菌主要致病因子有脂多糖、鞭毛、生物被膜、铁载体、胞外蛋白酶、外膜蛋白等。当前对于溶藻弧菌病害的防治仍然以抗生素为主,其大量使用容易使溶藻弧菌易产生耐药性,且存在药物残留等问题,因此亟需寻求一种绿色安全的防治手段。在细菌体内大量存在一种非编码的sRNA,可以快速合成并通过碱基配对的方式对靶标基因进行转录后调控,影响靶标mRNA的稳定性和翻译活性,广泛参与细菌的生理进程,而目前关于溶藻弧菌体内的细胞密度相关型的sRNA分子的鉴定及功能研究仅有Qrr1-5五个,未见其他报道。本课题利用高通量测序技术和生物信息学手段对不同细胞密度下溶藻弧菌体内差异表达sRNA分子进行筛选与鉴定,选取其中5个在不同细胞密度下差异表达最为显著的sRNA分子,分别命名为655,662,665,669,678,利用无标记缺失框手段构建缺失株,并利用回补质粒pBAD33构建相应的回补株,并进一步探究其对溶藻弧菌不同生理功能的影响,为安全有效的绿色防治手段提供理论基础。主要结果如下:(1)通过RNA-Seq高通量转录组测序技术,同时结合生物信息学手段,对低密度和高密度培养下的溶藻弧菌进行转录组测序,筛选得到146条sRNA分子,差异表达的sRNA一共有82个,其中高密度条件下较低密度上调表达的sRNA分子共47个,下调表达的sRNA分子共35个。并从中筛选五个表达差异较为显著的sRNA(655,662,665,669,678)作为研究对象,其中有3个上调表达,2个下调表达,均为新型sRNA分子,都具有启动子区域和终止子区域。荧光定量PCR结果也证明这5种sRNA分子全部真实存在。利用MFold对5种sRNA分子的二级结构进行预测,结果显示5种sRNA分子二级结构均具有RNA二级结构的典型特征,包含不同数量典型的茎环结构,在茎环临近处含有富含AU碱基的假定Hfq结合位点区,茎状结构区的碱基组成相对保守。利用Target RNA2对5种sRNA分子进行靶标mRNA的预测,结果显示不同的sRNA分子在溶藻弧菌基因组中均具有数十个靶标mRNA分子,且所涉及的生理功能也不尽相同。(2)利用无标记缺失突变株法成功构建分别缺失114bp的Δ678,298bp的Δ665,142bp的Δ669,221 bp的Δ655,106 bp的Δ662等5个缺失株。通过构建回补质粒成功得到5个回补菌株。在成功构建得到菌株之后,从生长特性、运动性、生物被膜、胞外多糖等方面进行其功能的研究,结果表明:5种细胞密度相关sRNA分子对溶藻弧菌的生长具有不同程度的影响,其中655最为显著,该sRNA的缺失使得溶藻弧菌的生长受到显著的抑制,其次为665,678,669,而662影响则相对较小。5种sRNA对于溶藻弧菌的游动性和爬动性均具有一定的促进作用,在基因缺失之后,其运动能力明显受到限制,对基因进行回补之后,其运动能力均有一定回复,但仍没有回复到野生型水平。对于爬动能力的调控主要通过对周生鞭毛合成蛋白LafK和LafA的激活作用来实现;而对于游动能力的影响,则主要通过对极生鞭毛合成相关蛋白FliS和FlaK的作用来实现。其中,669对于溶藻弧菌的运动能力的调控作用最为明显。5种sRNA对于溶藻弧菌生物被膜的形成也具有一定的促进作用,且通过对生物被膜调控因子SypG的转录后调控作用实现。5种sRNA对于溶藻弧菌胞外多糖的合成均具有一定的正向调控作用,其中665对溶藻弧菌胞外多糖的产生具有非常显著的调控作用。此外,这5种sRNA还对溶藻弧菌抗生素敏感性具有不同的调控作用,但对环境应激能力的作用不明显。(3)5种sRNA对溶藻弧菌群体感应系统核心元件LuxR和AphA具有不同的调控作用,首先通过Western blot检测得知,665、662、655对LuxR蛋白表达无明显作用,669和678对LuxR蛋白表达有一定的促进作用,通过RT-PCR结果得知:在菌株Δ655、Δ665和Δ662中,LuxR的mRNA水平相比野生型分别上调1.17、1.57以及0.57倍,在Δ669、Δ678菌株中,LuxR的mRNA水平相比野生型分别下调5.18和5.65倍,即669和678对LuxR的mRNA水平有较强的促进作用。在菌株Δ655、Δ665和Δ662中,AphA的mRNA水平相比野生型均为下调,Δ669、Δ678菌株中,AphA的mRNA水平相比野生型均为上调,表明669和678对AphA有抑制作用。同时5个sRNA分子对上游元件LuxU和LuxO具有一定的正向调控作用,即sRNA通过群体感应系统实现对靶标基因的精准调控。通过本研究将进一步丰富人们对溶藻弧菌毒力调控机制的认识,为后续溶藻弧菌病害新型防治手段的开发提供一定的理论依据。
【学位单位】：陕西科技大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S941.42
【部分图文】：

图 1-1 sRNA-mRNA 调节网络示意图-1 Schematic representation of the sRNA-mRNA mediated regulatorythe mRNA targets;Yellow box: sRNA; Blue circles: the regulaators; Green lines: upregulation of target gene; Red lines: indicates th酸酶至靶标 mRNA 分子影响其稳定性。下面对 sRNA 分机制进行阐述。制靶基因表达的作用机制的大多数sRNA分子对其靶标mRNA分子表达水平的影用，作用机制包括以下几种：NA 分子的 RBS 结合靶标 mRNA 分子的 RBS 区进行碱基配对，从而阻止 3起始，如图 1-2a[47]。大多数已深入研究的 sRNA 分子通码子来抑制靶标 mRNA 的翻译。然而系统的反义扫描研mRNA 分子第五个密码子后的序列发挥其翻译抑制作用，

陕西科技大学硕士学位论文'UTR 的位点相互作用阻碍了 30S 核糖体进入，而与第二个结合招募 RNaseE 使得 RyhB：msrB 降解。大量的 sRNA RNA 分子的 SD 序列结合，如 ptsG mRNA 分子 SD 序列中 分子 SgrS 对其抑制作用便完全去除。在大肠杆菌内，目A，如 Spot42:galK，GcvB:oppA，DsrA:hns，MicF:ompF

”sRNA 配对可使得 mRNA 上的这种翻译抑制结构打开，从而释放核糖体行蛋白质合成[67,68]。金黄色葡萄球菌表达一个大小约为 500nt 的 sRNA，R群体感应系统的调控，可通过其 5’末端与靶标 hla mRNA 分子 SD 序列中的进行碱基配对来消除翻译抑制结构的形成，从而激活 hla mRNA 分子的翻偶联激活些 sRNA 分子可通过与靶标基因 5’UTR 碱基配对正向调控其 ORF 表达，该 ORF 翻译偶联的来自不同顺反子的 mRNA 的翻译。铜绿假单胞菌中氧 sRNA，PhrS 在厌氧条件下对 ufo-pqsR 操纵子的激活作用便遵循该作用机下，PhrS 过量表达后可与 ufo 的 5’UTR 相互作用而改变其二级结构，使得释放，从而促进其翻译以及与之偶联反义的 pqsR 的翻译。NA 诱饵作用除作为抑制子的 sRNA 可激活其靶标 mRNA 的翻译，某些含有碱基配对能A 沉默序列的 RNA 分子能够与靶标 mRNA 分子间竞争性地结合 sRNA 分 sRNA 分子对于靶标 mRNA 分子的抑制作用被去除，促进蛋白质的合成示。

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本文编号：2811347