盐度影响金钱鱼生长及渗透相关基因的表达

发布时间：2020-09-16 11:43

　　金钱鱼(Scatophagus argus)是一种广盐性海洋物种,能够耐受大范围的环境盐度,是研究生长发育和盐度应激反应的理想模型。此外,该品种在中国广东省沿海地区广泛饲养,为当地水产养殖发展提供了可观的商业价值。盐度是影响鱼类生长发育的重要参数,是硬骨鱼在淡水和海水中面临的挑战之一。盐度在一定范围内波动会对鱼类的生长产生影响,具体表现为标准代谢率的变化、渗透调节能力的变化。环境盐度变化会对机体生长产生影响,影响生物维持体内渗透平衡。在环境盐度波动过程中,激素在维持硬骨鱼生理平衡和调节生长方面起着至关重要的作用。大量研究表明硬骨鱼的生长主要是由GH/IGF-I轴调控的,其中生长激素(Growth hormone,GH)发挥主要的作用。GH/IGF-I轴主要包括生长激素,生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)以及胰岛素样生长因子I(insulin-like growth factor I)等关键内分泌激素。在鱼类中,GH产生于垂体前叶,通过与生长激素受体(growth hormone receptor,GHR)结合发挥作用,最终在肝脏中促进IGF-I的合成。在硬骨鱼适应不同盐度海水的过程中,皮质醇发挥着重要的生理作用。皮质醇发挥其生理作用主要是通过与其受体结合来实现的,在硬骨鱼中皮质醇受体主要包括糖皮质激素受体(glucocorticoid receptors,GR)和盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptors,MR)。为了评估不同环境盐度对金钱鱼生长作用的影响,我们将金钱鱼在野外3处不同环境盐度(2±0.5、25±2.2和35±3.1)下饲养了5个月(从2015年4月到8月)。本研究中,首先我们通过分子生物学技术克隆了金钱鱼IGF-I和GHR的全长cDNAs,并通过半定量检测了GH、GHR和IGF-I在金钱鱼不同组织中的表达模式。通过RT-PCR技术测定了不同盐度下垂体中GH、肝脏中GHR和IGF-I mRNA的表达水平变化,通过ELISA测量不同盐度下血清中GH的含量。同时记录下金钱鱼不同采样时间里各个盐度实验样本的全长和体重数据,计算出每个月每组实验鱼的平均长度、平均体重(Body Weight,BW)和特殊生长生长率(special growth rate,SGR)。在硬骨鱼受环境盐度应时,在这个过程中体内的HPI轴发挥主要作用。皮质醇是HPI轴的重要组成成分,在硬骨鱼中,皮质醇可以通过特定的受体,如糖皮质激素受体(GR)和糖皮质激素受体(MR),同时发挥糖皮质激素和矿物质皮质激素的功能。然而,皮质醇对金钱鱼渗透调节作用的生理机制尚不清楚清楚。为了解决这个问题,我们通过分子生物学技术克隆获得了皮质醇受体GR和MR的cDNA全长序列,为以后的研究做基础。在本次研究中,将金钱鱼饲养在不同的盐度下(0,15,25,40)饲养7天。根据盐度大小分别简称为FW(fresh water)组,BW(brackish water)组,SW(sea water)组,HSW(high sea water)组。检测了不同盐度下鳃中NKA酶活性大小;利用渗透压仪检测不同盐度下金钱鱼血清渗透压的大小;利用ELISA试剂盒检测血清中皮质醇含量;利用RT-PCR技术检测GR和MR mRNA在金钱鱼渗透调节器官鳃肾中的表达水平变化;同时利用原位杂交技术来检测皮质醇受体GR和MR在海水和淡水金钱鱼渗透调节器官鳃和肾中的表达。本研究主要结果如下:1.克隆获得的GHR全长2689bp,ORF框长度1914bp,编码667个氨基酸。包含8个半胱氨酸残基,7个酪氨酸残基以及3个糖基化位点。通过与其他硬骨鱼氨基酸序列比对我们发现金钱鱼GHR在亲缘关系与石斑鱼最为接近。金钱鱼IGF-I cDNA序列全长2890bp,ORF框长度为588bp,编码186个氨基酸,包含11个半胱氨酸残基,2个酪氨酸残基。在亲缘关系上与大黄鱼最接近。2.RT-PCR结果显示,在同一个盐度下,垂体GH mRNA表达水平在采样时间范围内无明显变化;在不同盐度分组内,垂体中GH mRNA表达水平差异显著,与盐度大小呈负相关。肝脏中GHR、IGF-I mRNA表达水平和盐度呈正相关,盐度为35组表达最显著,盐度为25组其次,盐度为2组表达水平最低。肝脏中GHR、IGF-I mRNA表达水平从4月到7月逐渐升高,8月呈现下降趋势,暗示了GHR和IGF-I mRNA的表达水平可能还受天气温度的影响。ELISA结果表明,血清中的GH含量和盐度值大小成正比,盐度为2组含量最低,盐度为35组样本中血清GH含量最高。在盐度为2组中,血清中GH在4月到6月变化不显著,在7月明显升高,8月又呈现下降趋势;在盐度为25组中血清中4-6月变化不显著,6月开始血清中GH含量开始升高,升高趋势一直延续到8月;盐度为35组样本血清GH含量4月到7月期间呈明显提升趋势,变化显著(P0.05),到8月表达含量又呈现下降趋势。盐度为2、25、35时金钱鱼的SGR分别为0.68±0.12、0.44±0.08、0.23±0.06 g/d。各组间体重增量指数差异显著,说明并非所有能量都用于躯体生长,能量的大部分消耗在渗透调节方面。当鱼暴露在与内部体液等渗的环境中时,它们倾向于把较少的能量花在渗透调节上,从而把多余的能量分配给身体生长。根据金钱鱼体征数据结果可以看出金钱鱼在盐度为2组内生长速度最快,平全长度,平均体重均最高;盐度为25组其次,在盐度为35组中金钱鱼生长速度最缓慢。3.鳃中NKA酶活性大小以及血清渗透压大小和盐度呈正相关。RT-PCR结果显示,MR和GR在鳃、肾中的表达情况类似,在BW组中表达最显著,在FW组中表达水平最低,在SW和HSW组中表达水平接近。原位杂交结果表明,在鳃上皮细胞、和肾近端小管中均检测到GR和MR杂交信号。此外,在海水中,GR和MR mRNA表达水平显著高于淡水组。总的来说,鳃和肾中GR和MR的存在证明了它们在金钱鱼渗透调节和体内平衡过程中发挥重要作用,且两者的作用类似。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

硬骨鱼

图 1-1 硬骨鱼生长内分泌调控Fig1-1 Endocrine control of growth in the teleost fishH 的研究进展长激素（growth hormone，GH）、催乳素（prolactin, PRL）以及生长乳atolactin, SL）三者共同构成 GH/PRL/SL 家族。三者具有相似的结构且，因此有时被认为同一类多肽激素。GH 在鱼类中是一种由垂体嗜酸性的多肽类激素，在硬骨鱼的生长发育过程中起关键作用[8-10]。在硬骨鱼有多重作用，它能够促进繁殖[11]、调节渗透压[12]、调节食欲[13]以及调节。H 的结构特点类生长激素是由鱼类垂体分泌的一种由 173-188 个氨基酸组成的单链蛋，分子量大小在 20000-22000 道尔顿[15]。随着科学技术的发展，GH 的

硬骨鱼,皮质醇

所以在硬骨鱼中称为 HPI 轴。当下丘脑受到外源应激腺皮质激素（corticotropin releasing hormone, CRH），C体合成并分泌促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropin，液到达肾上腺皮质区域，促进肾上腺迅速合成皮质醇，皮丘脑和垂体，形成反馈调节回路，从而形成下丘脑-垂体节系统。硬骨鱼 HPI 轴调控途径如图 1-2 所示。在大多数醇是由（HPA-I）轴产生的主要皮质类激素，而在爬行动是主要的皮质类激素。皮质醇的分泌受到多种应激因素的热休克以及毒物等。皮质类固醇激素释放的最主要的生理，该生理过程涉及到糖酵解和糖异生，使机体能够应对外[126]。，皮质醇是由头肾的肾间细胞分泌产生并释放到血液中皮质醇被认为是唯一的生理活性形式。尽管在鱼类中未检白的存在（其他脊椎动物中有检测到），在一些研究中表低皮质醇的生物利用率。

凝胶电泳,中间片

-1 金钱鱼肝、鳃总 RNA 凝胶电泳图K:肝； G: 鳃Fig 2-1 Gel of S. argus tissues RNAIGF-I 的中间片段我们设计出了表 2-1。经琼脂糖凝胶电泳检测如图 2-2.① ②

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