对虾的病毒检测及IHHNV夹心ELISA检测方法的建立

发布时间：2020-09-18 21:17

　　 20世纪80年代,全球对虾养殖业进入了鼎盛时期,对虾养殖逐渐转变为集约化养殖模式。由于对虾养殖密度高,防治技术相对落后,导致对虾病毒性疾病的广泛暴发,使对虾养殖业遭受了巨大冲击。近年来我国的对虾养殖业依然受到诸如对虾白斑综合征(White Spot Disease,WSD)、传染性皮下及造血组织坏死病(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis,IHHN)和桃拉综合征(Taura Syndrome,TS)等传统病毒性疾病的威胁。这三种对虾病毒性疾病均具有传播速度快、发病率高、致死率高的特点,致使感染三种病毒的对虾品质和产量均明显下降,对虾养殖经济效益损失严重。目前,对虾病毒性疾病的特效药仍属于研究瓶颈,因此检测和防控是对虾健康养殖的主要手段。本文对2012年9月-2014年9月江苏、安徽和广东地区的348尾养殖对虾进行了白斑综合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)、传染性皮下及造血组织坏死病毒(Infectious Hypodermal and Hematopoietic Necrosis Virus,IHHNV)和桃拉综合征病毒(Taura Syndrome Virus,TSV)的检测,分别应用套式PCR、一步PCR和反转录PCR方法。比对WSSV-TH、WSSV-CN、WSSV-TW和9株实验室分离的WSSV ORF14/15序列,建立系统进化树,分析同源性和差异性。扩增IHHNVORF3基因序列,使用生物信息学软件分析一株南京分离病毒的疏水性、跨膜区、信号肽、二级结构、抗原表位、糖基化及磷酸化位点,与IHHNV-HI,IHHNV-CA,IHHNV-FJ,IHHNV-TH,IHHNV-TW 和 IHHNV-EC 比对,建立系统进化树。构建 pET32a-ORF3重组质粒,转化至E.coli BL21(DE3)进行大量表达,纯化pET32a-ORF3融合蛋白。以融合蛋白为抗原分别免疫ICR小鼠和新西兰白兔,获得小鼠血清和兔血清,纯化血清获得鼠源多克隆抗体IgG和兔源多克隆抗体IgG。使用鼠源多克隆抗体和兔源多克隆抗体建立IHHNV夹心ELISA法。江苏、安徽和广东地区WSSV阳性率为15.31%,IHHNV阳性率为4.31%,未检出TSV。WSSVORF14/15基因序列分析发现,9株WSSV可分为2大分支:分支1包括BA、BC、BE、BK、BI;分支2包括AG、SW、PH、JX。两个分支之间差异率在60%-80%,说明两个分支间的亲缘关系较远。IHHNV生物信息学分析结果表明,ORF3基因序列长度为990 bp,编码329个氨基酸,编码蛋白亲水性强,二级结构含有55.9%的a-螺旋、52.0%的β-折叠以及13.4%的β-转角,抗原表位分布较广泛、抗原性强,不存在潜在的N-糖基化位点,存在13个潜在的O-糖基化位点和17个潜在的磷酸化位点,符合衣壳蛋白特征.进化树结果表明,IHHNV-NJ株的ORF3基因编码蛋白序列与6株IHHNV序列同源性均高于96%,说明IHHNVORF3编码蛋白序列保守性强.本实验成功构建pET32a-ORF3重组质粒,获得纯化的pET32a-ORF3融合蛋白和鼠源多克隆抗体、兔源多克隆抗体。探究IHHNV夹心ELISA法的最佳条件为0.02 mol/L包被液4℃ 12h+37℃ 1h包被鼠抗(1:6400),10%小牛血清37℃封闭1h,抗原作用37℃ 1h,兔抗(1:3200)作用37℃ 1h,为制备IHHNV检测试剂盒提供了新的方法和基础。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S945.4
【部分图文】：

图１－２感染ＷＳＳＶ的对卧逡逑Ｆｉ．邋１－２邋Ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩＨＨＮＶ邋ｉｎ邋ｓｈｒｉｍ

W逡逑W Ｓ逡逑图１－３纯化的ＩＨＨＮＶ病毒粒子Ｐ９Ｊ逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＩＨＨＮＶ逡逑电子显微镜观察感染ＷＳＳＶ对砰组织切片和提纯的ＷＳＳＶ病毒粒子（图１￣４），逡逑可观察到ＷＳＳＶ为巧状病毒，无包涵体，双层囊膜，病毒由管状或分支状的空衣壳逡逑环绕，病毒大小为（３８０－２５０）邋ｎｍｘ邋（１５０－７０）邋ｎｍ，核衣壳大小为（３５０－３３０）邋ｎｍｘ邋（６７－５８）逡逑ｎｍ。核衣壳一端伸出一条长尾，内部包裹着ＷＳＳＶ的基因组。病毒粒子呈现交叉网逡逑线外观，由１４圈螺旋粒子环绕而成，螺旋粒子为８邋ｎｍ，成对平行排列。逡逑■ＢＫＨＢ逡逑图１＊４邋（Ａ）纯化的完整ＷＳＳＶ病毒粒子的电镜照片逡逑（Ｂ）邋ＷＳＳＶ病毒粒子巧衣亮的电镜照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｏｆ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＷＳＳＶ邋ｖｉｒｉｏｎｓ（Ａ）；逡逑Ｗ％Ｖ邋ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ（Ｂ）逡逑５逡逑

Ｓｈｉｋｅ等将ＩＨＨＮＶ归类于细小病毒科（Ｐａｒｖｏｖｉｒｉｄａｅ），浓核症病毒亚科逡逑（Ｄｅｎｓｏｖｉｒｉｎａｅ），短浓核症病毒属。逡逑W逡逑W Ｓ逡逑图１－３纯化的ＩＨＨＮＶ病毒粒子Ｐ９Ｊ逡逑Ｆｉｇ．邋１－３邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＩＨＨＮＶ逡逑电子显微镜观察感染ＷＳＳＶ对砰组织切片和提纯的ＷＳＳＶ病毒粒子（图１￣４），逡逑可观察到ＷＳＳＶ为巧状病毒，无包涵体，双层囊膜，病毒由管状或分支状的空衣壳逡逑环绕，病毒大小为（３８０－２５０）邋ｎｍｘ邋（１５０－７０）邋ｎｍ，核衣壳大小为（３５０－３３０）邋ｎｍｘ邋（６７－５８）逡逑ｎｍ。核衣壳一端伸出一条长尾，内部包裹着ＷＳＳＶ的基因组。病毒粒子呈现交叉网逡逑线外观，由１４圈螺旋粒子环绕而成，螺旋粒子为８邋ｎｍ，成对平行排列。逡逑■ＢＫＨＢ逡逑图１＊４邋（Ａ）纯化的完整ＷＳＳＶ病毒粒子的电镜照片逡逑（Ｂ）邋ＷＳＳＶ病毒粒子巧衣亮的电镜照片逡逑Ｆｉｇ．邋１－４邋Ｅｌｅｃｔｒｏｎ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ邋ｏｆ邋ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ＷＳＳＶ邋ｖｉｒｉｏｎｓ（Ａ）；逡逑Ｗ％Ｖ邋ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｓ（Ｂ）逡逑５逡逑

【参考文献】

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本文编号：2822190