Beclin-1、AMPKβ和Akirin参与中华绒螯蟹抗细菌免疫的功能研究

发布时间：2020-09-21 07:56

　　中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)是我国重要的水产养殖物种之一,具有重要的经济价值和科研价值。然而,细菌性疾病的频发为中华绒螯蟹养殖产业带来了严重的经济损失。本研究以中华绒螯蟹为研究对象,利用免疫荧光、实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRT-PCR)、免疫印迹实验(Western blot)和双链RNA干扰(Double strands RNA interference,dsRNAi)等生物学技术分析了Beclin(命名为EsBeclin-1)、腺苷酸激活蛋白激酶β亚基(AMP-activated protein kinaseβsubunit,AMPKβ,命名为Es AMPKβ)和Akirin(命名为EsAkirin)的分子特征及其参与调控抗菌肽表达的功能。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的开放阅读框分别为1 275 bp、888 bp和615 bp,各编码424、295和204个氨基酸。EsBeclin-1具有典型的APG6结构域及CCD和ECD结构域;EsAMPKβ具有典型的AMPKβ和CBM结构域;EsAkirin没有明确的结构域,但具有较保守的氨基端和羧基端结构及两个保守的核定位序列。EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin均呈组成型表达。免疫荧光分析结果表明,EsBeclin-1和EsAMPKβ蛋白主要分布在血淋巴细胞细胞质中,EsAkirin主要分布在细胞核中。利用qRT-PCR检测了脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激后中华绒螯蟹血淋巴细胞中EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表达变化情况。结果表明LPS和A.hydrophila刺激后,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的mRNA表达水平显著升高,分别在刺激后6 h(为对照组的4.70±0.70倍和2.91±0.46倍,p0.01)、12 h(为对照组的3.19±0.58倍和2.69±0.30倍,p0.01)和24 h(为对照组的5.04±1.01倍和3.10±0.84倍,p0.01)达到最高表达水平。此外,LPS刺激2 h后,血淋巴细胞中的EsBeclin-1蛋白出现聚集,呈斑点状分布。为研究EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin对抗菌肽表达的调节作用,本研究利用dsRNA抑制EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的表达(dsRNA注射24 h后干扰效率均达60%以上),并在此基础上对血淋巴细胞中抗菌肽的表达水平进行检测。结果表明,LPS刺激EsBeclin-1干扰的中华绒螯蟹6 h后,EsALF2(0.55±0.08倍,p0.05)、EsLYZ(0.21±0.04倍,p0.01)、EsCrus(0.49±0.08倍,p0.01)和EsCrus2(0.46±0.11倍,p0.01)的表达水平显著低于对照组;EsAMPKβ干扰后,EsALF2(0.44±0.10倍,p0.01)和EsLYZ(0.69±0.20倍,p0.05)的表达水平受到抑制;LPS刺激EsAkirin干扰的中华绒螯蟹12 h后,EsALF2(0.26±0.07倍,p0.01)、EsLYZ(0.54±0.10倍,p0.01)、EsCrus2(0.54±0.17倍,p0.01)和EsDWD1(0.56±0.1倍,p0.05)的表达量显著降低。利用双荧光素酶报告系统检测发现,EsAkirin能显著增强NF-κB启动子表达质粒的荧光素酶活性(2.72±0.40倍,p0.01)。综上所述,EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin的分子结构均较为保守,具有典型的结构特征;EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin都参与LPS和A.hydrophila刺激引起的免疫应答;EsBeclin-1和EsAMPKβ分布在中华绒螯蟹血淋巴细胞细胞质中,EsAkirin分布在细胞核中;EsBeclin-1能影响EsALF2、EsLYZ、EsCrus和EsCrus2的转录,EsAMPKβ参与EsALF2和EsLYZ的调节,EsAkirin在EsALF2、EsLYZ、EsCrus2和EsDWD1的调节过程中具有重要作用;EsAkirin能通过增强NF-κB的活性。以上结果表明EsBeclin-1、EsAMPKβ和EsAkirin之间可能通过同一途径共同调节EsALF2和EsLYZ的转录,参与中华绒螯蟹抗细菌免疫。本研究不仅为进一步探索甲壳动物抗细菌免疫防御机制提供了理论依据,而且为无脊椎动物免疫调节机制的研究提供了参考。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

原理图,无脊椎动物,原理图,适应性免疫

1 前言无脊椎动物免疫脊椎动物的免疫系统分为固有免疫和适应性免疫，在复杂的环境中具有更加完备机制。然而，无脊椎动物不具有类似脊椎动物的适应性免疫，在充满各种刺激的，无脊椎动物依赖固有免疫阻止病原入侵。无脊椎动物免疫系统主要由细胞免疫免疫构成，其中细胞免疫主要包括吞噬、黑化和包囊及细胞粘连作用等，体液免包括抗菌肽合成、酚氧化还原酶释放、凝集素以及补体分子等（见图 1-1）[1]。

脊椎动物,哺乳动物,中都,途径

图 1-2 Toll 和 IMD 通路调节 AMPs 基因的表达ig 1-2 The Toll and IMD signaling pathways in regulating the expression of antimicrobial peptiBeclin-1、AMPK 和 Akirin 参与调节 Toll 和 IMD 通路现已知 Toll 和 IMD 通路在无脊椎动物的固有免疫中发挥着重要作用，并且，物 Toll 通路与哺乳动物 IL-1/TLR 通路非常相似（见图 1-3），他们具有相似的同的信号传递分子（如 Myd88 、肿瘤坏死因子相关受mor necrosis factor receptor-associated factor 6, TRAF6）和 Cactus），IMD 通路与 TNF-R 途径相似[37]。研究表明，脊椎动物和无脊椎动物的 Beclin-1、AMPK 和些通路中都发挥着一定的作用，下面主要简述 Beclin-1、AMPK 和 Akirin 的分其参与的一些过程。

信号转导通路,结构域

图 1-3 TLR 信号转导通路Fig 1-3 TLR signaling pathway Beclin-1 的特征及其参与免疫调节的研究998 年，Liang 等在大鼠的致死性辛德毕斯病毒性脑炎（Fatal sindbhalitis）研究中发现了与 Bcl-2 发生相互作用的蛋白 Beclin[38]。随后，在人s）、果蝇（D. melanogaster）及线虫（Caenorhabditis elegans）等物种中也eclin。哺乳动物有两个 Beclin，分别命名为 Beclin-1 和 Beclin-2，其他脊椎动物中只存在 1 个 Beclin 基因，命名为 Beclin-1 或 Atg6[39]。Beclin 蛋白具结构域：BH3 结构域（Bcl-2 homolog 3 (BH3) domain）、中央卷曲螺旋tral coiled-coil domain, CCD）和进化保守结构域（Evolutionarily conserved （见图 1-4A）。ECD 结构域在不同物种之间高度保守，HsBeclin-1 的 ECD结构分析表明，ECD 结构域是由 4 个 α 螺旋、3 对相互平行的 β 折叠和 6环形结构共同形成的紧密球体，其显著特征是其第四个环形结构从主体突端具有 3 个连续的芳香氨基酸（见图 1-4B）[40]。

【参考文献】