三角帆蚌凝集素和C1qDC蛋白在先天免疫中的功能研究

发布时间：2020-09-29 15:46

　　贝类是重要的水产养殖动物,可创造出巨大的经济价值。然而,近年来病害的频繁侵袭使水产养殖业遭受了巨大的经济损失,为了预防和控制贝类水产养殖病害的发生,深入研究其免疫防御机制是很有必要的,尤其是对病原识别机制的研究。C-型凝集素和ClqDC蛋白是重要的病原识别分子,但目前对于其功能的研究还很少。为了阐明他们在抵制病原入侵过程中的作用,以及他们是否具有特异性,我们用软体动物对其相关功能做了一些研究。本研究选取三角帆蚌作为实验动物,研究C-型凝集素和含Clq结构域蛋白在其免疫防御中的作用。1、三角帆蚌C-型凝集素(HcLec4)作为模式识别受体参与抗细菌免疫反应在无脊椎动物中已有报道,许多C-型凝集素(CTL)参与了先天免疫反应,如多酚氧化酶的激活,细胞的黏附,细菌清除和吞噬作用,以往的研究主要集中在C-型凝集素糖识别结构域(CRDs)功能方面。目前,对三角帆蚌C-型凝集素CRD结构域功能方面的研究还很少。本研究以三角帆蚌作为实验动物,从三角帆蚌克隆得到一个含有四个CRD结构域的凝集素基因,命名为HcLec4,该基因四个CRD结构域被分别命名为CRD1、CRD2、CRD3和CRD4,并对该HcLec4基因在先天免疫中的功能进行了初步的研究。运用RACE技术得到该基因cDNA序列的全长,为2218bp,拥有一个1860bp的开放阅读框,编码620个氨基酸。多序列比对和系统进化树分析显示,该基因的四个CRD蛋白彼此之间有所不同。在mRNA水平上,HcLec4广泛分布于三角帆蚌被检测的组织中,包括血细胞、肝胰腺、鳃、外套膜和斧足,并在肝胰腺中具有相对较高的表达水平。HcLec4基因在肝胰腺组织中,受金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和副溶血弧菌感染后,其在感染初期(2h)表达量显著下调。我们进一步分析了HcLec 基因四个CRD结构域的细菌结合和糖结合活性,结果显示,四个CRD结构域能与多种细菌、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PGN)结合。沉默HcLec4基因后,其细菌清除能力提高,抗菌肽(AMPS)表达水平上调。综上所有实验结果表明,HcLec4基因可能在细菌感染早期通过调节抗菌肽的表达发挥抗菌作用。2、三角帆蚌HcClqDC基因作为模式识别受体参与抗细菌免疫应答反应Clq是补体C1复合物的关键部件,这部分包含有一个球状Clq (gClq)结构域,此结构域具有显著的配体结合特性。Clq结构域包含蛋白(ClqDC)由一个gClq域组成,在无脊椎动物中存在许多能够识别非自我配体的ClqDC蛋白。本研究我们从三角帆蚌中鉴定出四个HcClqDC基因,即HcClqDCl-HcClqDC4。HcClqDC1-HcClqDC4 分别编码 224、204、305 和 332 个氨基酸。HcClqDCl-HcClqDC3基因序列的C末端含有一个gClq域,HcClqDC4基因序列中除了有一个gClq域之外,还有一个卷曲螺旋区。多序列比对和系统进化树分析显示,四个HcClqDC基因与来自软体动物的ClqDC基因具有高度的同源性。组织分布结果显示,HcClqDCl-HcClqDC4广泛分布于血细胞、肝胰脏、鳃、外套和斧足中。表达模式结果显示,四个HcClqDC基因在细菌感染后其表达量变化较明显。细菌结合实验结果显示,四个重组的HcClqDC蛋白对所选取的细菌都有结合活性。综上所有实验结果表明,四个HcClqDC基因可能作为模式识别受体参与了抗细菌免疫应答作用。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S944.2
【部分图文】：

技术路线图,基因,技术路线,病害防治

效的病害防治方式提供新的思路和理论指导。逡逑１．６．３技术路线逡逑采用以下技术路线对本实验进行相关的研[偅缤迹保插义希暄镜氖占义希驽危危危掊危鲥危胱橹植煎义先欠龈咄坎庑蝈义匣蚝停茫欤瘢模缅澹煎澹刍竦茫牛樱孕颍叔危ā危掊邋五义系鞍椎墓δ苎绣冲危恚遥危了藉澹掊灞泶锬Ｊ藉义希郑叔危坼骞δ苎绣冲危卞邋五邋五义希蓿掊蜗妇宄义希危危箦危掊澹樱椋遥危铃迩佩澹у义希掊澹遥粒茫偶际趸窕澹叔五五五义弦蛉ば蛄绣澹苠危煽咕募觳忮义希体危叔五五邋五义现刈楸泶镥义希危掊澹驽逶靥骞菇ㄥ义希ǖ鞍姿剑卞五五义希龉δ軃w逦「卜糖结合）逡逑４邋ｓａｍ邋）邋＾逡逑１｜细菌结合逡逑图１．２／／ｃＬｍ／

蛋白纯化,聚丙烯酰胺凝胶电泳,纯度,肝胰腺

逑作为内参基因，我们选取了五种组织进行了研宄，包括血细胞、肝胰腺、逡逑鳃、外套膜和斧足，结果表明Ｚ／ｃＺｅｄ在被检测的五种组织中均有分布（图２．４Ａ），逡逑其中，在肝胰腺组织中表达量最高。逡逑此外，使用实时荧光定量ＰＣＲ方法检测了邋Ｚ／ｃＺｅｃ＃在ＰＢＳ、大肠杆菌、副逡逑溶血弧菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌刺激后在肝胰腺组织中的表达模式。逡逑实验结果表明，在ＰＢＳ刺激后／／ｅｌｅｃ＃表达水平无明显变化（图２．４Ｂ），作为实逡逑验对照组，Ｚ／ｃＺｅｃ彳在大肠杆菌感染后２邋ｈ和１２邋ｈ表达量显著下调（图２．４Ｃ），／／ｃＩｅｃ４逡逑在副溶血弧菌感染后２ｈ表达量显著下调，２４ｈ达到最高水平（图２．４Ｄ），逡逑在枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌感染后２邋ｈ表达量显著下调，１２邋ｈ达到最高水逡逑平（图２．４Ｅ和２．４Ｆ）。因此

三角帆蚌,肝胰腺,副溶血弧菌,基因

ＧＦＰ－ＲＮＡｉ组肝胰腺组织中的表达情况（图Ａ）。ＨｃＬｅｄ基因沉默后，向三角帆蚌斧足中注逡逑射入金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌，收集血淋巴并将其培养在ＬＢ平板上，计算细菌数，ＧＦＰ逡逑作为对照（图２．７Ｂ和２．７Ｃ）。ｄｓＲＮＡ注射入三角帆蚌斧足内，两天后，再向三角帆蚌斧足逡逑内注射入金黄色葡萄球菌和副溶血弧菌，然后，通过实时定量ＰＣＲ检测／ｆｏｉｅ以表达水平逡逑（２．７Ｄ）。ｑＲＴ－ＰＣＲ邋检测抗菌肽因子邋Ｔｈｅ，邋ＴＮＦ，邋ＷＡＰ１邋和邋ＷＡＰ２邋的表达水平（２．７Ｅ、２．７Ｆ、逡逑２．７Ｇ、２．７Ｈ），星号表示实验组与对照组差异的显著性（Ｐ＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ邋２．７邋（Ａ）邋ＨｃＬｅｃ４邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｉｎ邋ｔｈｅ邋ｈｅｐａｔｏｐａｎｃｒｅａｓ邋ｉｎ邋ｎｏｒｍａｌ邋ｍｕｓｓｅｌｓ邋（ｌｅｆｔ邋ｃｏｌｕｍｎ），逡逑／／ｄｅｃ彳－ＲＮＡｉ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｍｉｄｄｌｅ邋ｃｏｌｕｍｎ），邋ａｎｄ邋Ｇ／Ｐ－ＲＮＡｉ邋ｇｒｏｕｐ邋（ｒｉｇｈｔ邋ｇｒｏｕｐ）邋ａｎａｌｙｚｅｄ邋ｂｙ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ．逡逑（２．７Ｂ邋ａｎｄ邋２．７Ｃ）邋Ｍｕｓｓｅｌｓ邋ｗｅｒｅ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｗｉｔｈ邋Ｓ．邋ａｕｒｅｕｓ邋ａｎｄ邋Ｖ．邋ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ邋ｓ＆ｓｘ邋ＨｃＬｅｃ４邋ｗａｓ逡逑ｋｎｏｃｋｅｄ邋ｄｏｗｎ．邋Ｔｈｅ邋ｈｅｍｏｌｙｍｐｈ邋ｗａｓ邋ｅｘｔｒａｃｔｅｄ邋ａｎｄ邋ｃｕｌｔｕｒｅｄ邋ｏｎ邋ａ邋ＬＢ邋ｐｌａｔｅ邋ｆｏｒ邋ｂａｃｔｅｒｉａｌ邋ｃｏｕｎｔ．邋ＧＦＰ逡逑ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ａｓ邋ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ．邋（２．７Ｄ）邋ｄｓＲＮＡ邋ｗａｓ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ邋ｉｎｔｏ邋ｍｕｓｓｅｌｓ

【参考文献】