芽孢杆菌筛选及其对凡纳滨对虾生长、免疫力和抗逆性的影响研究
发布时间：2020-09-30 15:59
近年来,病毒性和细菌性疾病的频繁爆发,给水产养殖业带来了巨大的养殖风险和压力。水产养殖疾病预防和治疗的主要措施是利用各种抗生素,这在疾病治疗中起到了积极的作用,但同时也带来了病原菌耐药性、水生动物体内菌群失调、抗生素残留、食品安全以及海洋环境污染等问题,且这些问题正在变得越来越严重,不仅严重制约了水产养殖业的健康可持续发展,而且也导致了巨大的环境安全风险。当人们认识到使用抗生素等药物的负面影响后,人们开始寻找天然无毒、无残留、无污染的安全高效的疾病预防措施。益生菌是一类繁殖速度极快,对环境适应能力极强,对有机质等污染物分解极快,种类繁多,分布极广的微生物,在养殖业得到了广泛使用。本研究采用酶活测定和溶血活性检验从来源于对虾养殖水环境的12株芽孢杆菌中,筛选出4株分泌胞外酶且没有潜在毒性的芽孢杆菌。4株芽孢杆菌通过耐受胆盐、耐人工胃液、耐人工肠液、抑菌活性、表面疏水性和自凝聚力等试验,从中筛选出2株芽孢杆菌,然后将其通过拌料投喂的方式应用于凡纳滨对虾仔虾阶段养殖,比较研究了所选芽孢杆菌对凡纳滨对虾各项生理指标以及水质的影响,实验结果如下:通过测定12株芽孢杆菌蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶胞外酶活分泌能力,以及利用山羊血平板法检测12株芽孢杆菌的潜在致病性,发现12株芽孢杆菌都具有分泌胞外酶的能力,其中,HNLS-1和HNLD-1分别具有最高的蛋白酶和脂肪酶分泌能力,HNLS-1、HNLD-1和HNSY-1具有较高的分泌淀粉酶能力;溶血试验结果显示HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1,共4株芽孢杆菌在山羊血平板上呈γ溶血,其他8株芽孢杆菌都呈β溶血。综合高效分泌胞外酶能力和溶血活性两方面实验结果,初步选定芽孢杆菌HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1为凡纳滨对虾养殖的潜在益生菌的备选菌株。利用耐受胆盐、耐人工胃液、耐人工肠液、抑菌活性、表面疏水性和自凝聚力等实验方法,对筛选出的HNLS-1、HNLD-1、HNLD-2和HNSY-1进行了体外益生效果研究。结果显示菌株HNLS-1、HNLD-1、HHNLD-2在0.6%的高浓度胆盐条件下活菌数都较高,而HNSY-1在0.15%低浓度的胆盐条件下不能生长;菌株HNLS-1、HNLD-1、HNSY-1在人工模拟胃液中培养180min后活菌数基本不受影响,HNLD-2培养60min后活菌数降低1 log值;在人工肠液中培养180min后,4株菌的活菌数基本不变;在与病原菌的拮抗试验中HNLS-1、HNLD-1、HNSY-1分别对部分弧菌具有拮抗效果,HNLD-1和HNSY-1分别对副溶血弧菌和创伤弧菌拮抗效果最明显,抑菌圈分别为14.53mm和11.43mm, HNLD-2对病原菌没有拮抗效果;在对二甲苯的疏水活性试验中HNLD-1和HNLS-1对二甲苯的疏水活性显著高于HNLD-2和HNSY-1,分别达到73.2%和64%; 4株芽孢杆菌在5h内,自凝聚率都随培养时间逐渐升高,但HNLD-1和HNLS-1 3h后的自凝聚力明显高于HNSY-1和HNLD-2, 5h分别达到最高凝聚率52%和58.5%。综上结果表明,在4株芽孢杆菌中,HNLS-1和HNLD-1具备更好的体外益生菌特性,可进一步研究其在水产动物营养和日粮中的应用效果。HNLS-1和HNLD-1经革兰氏染色、细菌生理生化鉴定法和16S rDNA序列比对显示,分别鉴定为地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)和弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus) 。采用拌料投喂的方式,对益生菌株HNLS-1和HNLD-1对凡纳滨对虾仔虾生长、免疫、抗病力和水质的影响进行了研究,结果显示:将益生菌HNLS-1和HNLD-1单独和混合的方式拌入饲料,菌浓度为2.0×109CFU/g的饲料对凡纳滨对虾仔虾饲喂20d,添加益生菌的处理组,其仔虾存活率和特定生长率均显著提高(P0.05),水中氨氮、COD含量以及弧菌总量均显著低于对照组(P0.05),在淡水、40‰海水和300mg/L亚硝酸盐极端环境胁迫下,抗逆性均强于对照组,在浓度为107CFU/mL的哈维氏弧菌强毒株环境下攻毒1周后,存活率均显著高于对照组(P0.05);添加益生菌的处理组与对照组相比,均可显著提高凡纳滨对虾组织中的蛋白酶、脂肪酶、碱性磷酸酶和溶菌酶活力(P0.05),HNLS-1和HNLD-1处理组亦显著提高了其过氧化物酶活力(P0.05)。由上可见,HNLS-1和HNLD-1能够促进凡纳滨对虾的健康生长并提高其抗病能力、改善其生长水环境,因而可作为益生菌应用于凡纳滨对虾养殖中。综上所述,HNLS-1和HNLD-1可以有效地促进凡纳滨对虾仔虾的健康生长、增强抗病力,改良水质,为筛选更多凡纳滨对虾专用益生菌提供了理论依据。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S968.22
【部分图文】：
４．７表面疏水活性逡逑ＨＮＬＤ－１和ＨＮＬＳ－１对二甲苯的疏水活性显著高于ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１，分别达到逡逑７３．２％和６４％，邋ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１对二甲苯的疏水活性没有显著性差异（图１）。逡逑ｉｌｉｉｌ逡逑ＨＮＬＤ－１邋ＨＮＬＳ－１邋ＨＮＬＤ－２邋ＨＮＳＹ－１逡逑图１邋４株菌对二甲苯的表面疏水性逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｆｏｒ邋ｘｙｌｅｎｅ逡逑４．８自凝聚力逡逑在化内，随着培养时间增加，每株菌的自凝聚率都逐渐升高，但ＨＮＬＤ－１和逡逑ＨＮＬＳ－１３ｈ后的自凝聚为明显高于ＨＮＳＹ－１和ＨＮＬＤ－２，化凝聚率达到５２％和５８．５％；．逡逑ＨＮＬＤ－２自凝聚效果最差，化后凝聚率才２５．８％邋（图２）。逦＾逡逑７０邋１逡逑８邋５０邋—逦－＾ＨＮＬＤ－１逡逑ｆ邋２０邋－香扫ＮＳＹ－１逡逑ＩＱ邋＿逦－＾ＨＮＬＤ－２逡逑０邋＾逦ｉ逦Ｉ逦ｉ逦ｉ逦Ｉ逡逑１逦２逦３逦４逦５逡逑ｒｉｍｅ邋（ｈ）逡逑国２４株菌的自凝聚力逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋Ａｕｔｏａｇｇｒｅｇａｔｉｏ
１４４６ｂｐ的基因片段，将这２株菌株的基因序列与Ｇｅｎｂａｎｋ中同源性最高的及亲缘关系逡逑较远的共２４株其他菌株的基因序列进行同源性比对和多序列匹配排列，构建系统进化逡逑树（图３），结果表明：ＨＮＬＳ－１与３株地衣芽抱杆菌聚为一支，ＨＮＬＤ－１与２株弯曲芽抱逡逑杆菌聚为一支，置信度达９９％，同亲缘关系较远的枯草芽袍杆菌（化化）、环逡逑状芽拖杆菌（ＳａｃＷｗｃｉｒｃｗ／ｏＭＳ）、凝结芽抱杆菌短小芽抱杆菌逡逑（公口础山／＞？７？？化５）等分支明显。结合生化鉴定和表型特征，可＾判定吐化８－１为地衣逡逑芽抱杆菌。ＨＮＬＤ－１为弯曲芽抱杆菌。逡逑１６逡逑
分别为１．９４ｍｇ／Ｌ，邋１．９５ｍｇ／Ｌ，２．１９ｍｇ／Ｌ，显著低于对照组的３．７３ｍｇ／Ｌ。９天后，逡逑每个组ＮＨ３－Ｎ浓度都开始下降，但对照组ＮＨ３－Ｎ含量总体高于添加芽抱杆菌的Ｈ个纽。逡逑（图１）逡逑４．５邋］逡逑４邋－逦Ｔ逡逑穿邋２．５邋尸－－？－ＨＮＬＤ－１逡逑x铮保幻词簦簨逡逑１邋－逦ｗＯｗ邋鲁对瀩逡逑０，５邋－逦Ｉ邋＊逦？逡逑０邋■＊逦！邋Ｉ邋ｉ邋！邋ｆ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋Ｉ逡逑０逦１逦３逦５逦７逦９邋１１邋１３邋１５邋１７邋１９逡逑养殖天数逡逑图１水中ＮＨｉ－Ｎｔ变化逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎ化ａｔｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ＮＨｓ－Ｎｔ邋ｉｎ邋ｗａｔｅｒ逡逑３N２亚硝酸盐逡逑对各组Ｎ０２－Ｎ浓度平均值进行单因素方差分析，结果显示，实验组与对照组水体逡逑中Ｎ０２－Ｎ含量都没有显著性差异。＞０．０５）。养殖０－７天内，各组Ｎ０２－Ｎ含量都缓慢X楀义铣ぃ髯橹涞模危茫瑁魏棵挥邢灾钜臁＃诽旌螅龋危蹋樱保龋危蹋模弊橛攵哉兆殄义希危埃玻魏靠佳杆偕撸龋危蹋樱弊楹停龋危蹋模弊樵冢固旌蟛趴佳杆賆椉印８髯殄义显诘冢保程欤危埃玻闻ǘ却锏剑埃叮恚纾蹋咨喜⑶饔谖榷ā＃ㄍ迹玻╁义希玻插义
本文编号：2831041
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S968.22
【部分图文】：
４．７表面疏水活性逡逑ＨＮＬＤ－１和ＨＮＬＳ－１对二甲苯的疏水活性显著高于ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１，分别达到逡逑７３．２％和６４％，邋ＨＮＬＤ－２和ＨＮＳＹ－１对二甲苯的疏水活性没有显著性差异（图１）。逡逑ｉｌｉｉｌ逡逑ＨＮＬＤ－１邋ＨＮＬＳ－１邋ＨＮＬＤ－２邋ＨＮＳＹ－１逡逑图１邋４株菌对二甲苯的表面疏水性逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ邋ｏｆ邋４邋ｓｔｒａｉｎｓ邋ｆｏｒ邋ｘｙｌｅｎｅ逡逑４．８自凝聚力逡逑在化内，随着培养时间增加，每株菌的自凝聚率都逐渐升高，但ＨＮＬＤ－１和逡逑ＨＮＬＳ－１３ｈ后的自凝聚为明显高于ＨＮＳＹ－１和ＨＮＬＤ－２，化凝聚率达到５２％和５８．５％；．逡逑ＨＮＬＤ－２自凝聚效果最差，化后凝聚率才２５．８％邋（图２）。逦＾逡逑７０邋１逡逑８邋５０邋—逦－＾ＨＮＬＤ－１逡逑ｆ邋２０邋－香扫ＮＳＹ－１逡逑ＩＱ邋＿逦－＾ＨＮＬＤ－２逡逑０邋＾逦ｉ逦Ｉ逦ｉ逦ｉ逦Ｉ逡逑１逦２逦３逦４逦５逡逑ｒｉｍｅ邋（ｈ）逡逑国２４株菌的自凝聚力逡逑Ｆｉｇ．２邋Ｔｈｅ邋Ａｕｔｏａｇｇｒｅｇａｔｉｏ
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分别为１．９４ｍｇ／Ｌ，邋１．９５ｍｇ／Ｌ，２．１９ｍｇ／Ｌ，显著低于对照组的３．７３ｍｇ／Ｌ。９天后，逡逑每个组ＮＨ３－Ｎ浓度都开始下降，但对照组ＮＨ３－Ｎ含量总体高于添加芽抱杆菌的Ｈ个纽。逡逑（图１）逡逑４．５邋］逡逑４邋－逦Ｔ逡逑穿邋２．５邋尸－－？－ＨＮＬＤ－１逡逑x铮保幻词簦簨逡逑１邋－逦ｗＯｗ邋鲁对瀩逡逑０，５邋－逦Ｉ邋＊逦？逡逑０邋■＊逦！邋Ｉ邋ｉ邋！邋ｆ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋ｉ邋Ｉ逡逑０逦１逦３逦５逦７逦９邋１１邋１３邋１５邋１７邋１９逡逑养殖天数逡逑图１水中ＮＨｉ－Ｎｔ变化逡逑Ｆｉｇ．ｌ邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｅｎ化ａｔｉｏｎ邋ｃｈａｎｇｅ邋ｏｆ邋ＮＨｓ－Ｎｔ邋ｉｎ邋ｗａｔｅｒ逡逑３N２亚硝酸盐逡逑对各组Ｎ０２－Ｎ浓度平均值进行单因素方差分析，结果显示，实验组与对照组水体逡逑中Ｎ０２－Ｎ含量都没有显著性差异。＞０．０５）。养殖０－７天内，各组Ｎ０２－Ｎ含量都缓慢X楀义铣ぃ髯橹涞模危茫瑁魏棵挥邢灾钜臁＃诽旌螅龋危蹋樱保龋危蹋模弊橛攵哉兆殄义希危埃玻魏靠佳杆偕撸龋危蹋樱弊楹停龋危蹋模弊樵冢固旌蟛趴佳杆賆椉印８髯殄义显诘冢保程欤危埃玻闻ǘ却锏剑埃叮恚纾蹋咨喜⑶饔谖榷ā＃ㄍ迹玻╁义希玻插义
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