异育银鲫Ⅰ型干扰素基因的克

发布时间：2020-09-30 15:34

　　异育银鲫(Carassius auratus gibelio)是我国主要的淡水养殖品种之一。由鲤疱疹病毒II型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)感染引起的鲫造血器官坏死症是一种严重的病毒性传染病,给水产养殖业造成了巨大的经济损失,开展鲫鱼抗病毒防御机制研究对其病毒性疾病的防控具有重要的现实意义。干扰素(Interferon,IFN)是一类重要的分泌型细胞因子,能够抑制病毒增殖和调节机体免疫应答,在先天性和适应性免疫中发挥着重要作用。目前,I型干扰素(IFN-I)已在多种硬骨鱼类中得到研究,但有关异育银鲫IFN-I的研究还未深入开展。本研究克隆获得一种异育银鲫IFN-I基因(CagIFNa),完成了对该基因的鉴定和序列结构分析,分析了CagIFNa在体内和体外的表达模式,并对CagIFNa在鲫鱼脑细胞系(Gibel carp brain cell line,GiCB)中抵抗CyHV-2感染的抗病毒活性进行了研究。旨在进一步揭示鱼类先天性抗病毒感染机制,为鲫鱼疱疹病毒造血器官坏死症的有效防控奠定理论基础。主要结果如下:1.CagIFNa的克隆和序列结构分析基于RACE PCR技术,以异育银鲫肾脏组织总RNA为模板进行扩增,得到CagIFNa基因cDNA序列全长为724 bp,预测ORF长度为552 bp,可编码183个氨基酸。CagIFNa序列中存在两个保守的半胱氨酸残基(C1:C~(24),C2:C~(120)),N端含有一个长度为23个氨基酸的信号肽。氨基酸序列相似性分析表明,CagIFNa与鲤科鱼类IFN的相似性最高。系统发育树结果显示,CagIFNa与硬骨鱼类I类IFN-I家族的IFNa亚型基因聚为一支。2.CagIFNa体内表达特征荧光定量PCR检测结果显示:CagIFNa在健康异育银鲫被检测的9种组织中均有表达,并且肝脏、肠、脾脏和头肾中的表达水平相对较高。异育银鲫感染CyHV-2后,头肾中CagIFNa的表达量在12 h、24 h和48 h与对照组相比显著下调,然而120 h的表达量显著上调至对照组的6倍;脾脏中CagIFNa的表达量在感染后24 h、48 h和120 h与相应对照组相比均显著下降。3.Poly I:C刺激和CyHV-2感染条件下CagIFNa体外时序表达模式荧光定量PCR检测结果显示:poly I:C刺激GiCB细胞后,细胞中CagIFNa的表达量从6 h开始显著升高,12 h达到峰值,为相应对照组的347倍,随后表达量下降但仍高于对照组;CyHV-2感染后,细胞中CagIFNa的表达量在6 h显著上调,随后表达量逐渐下降,但在120 h表达量显著上调并达到峰值,为对照组的10.7倍。4.CagIFNa的抗病毒活性研究构建真核表达质粒pCMV-HA-CagIFNa并转染GiCB细胞,western-blot检测结果显示:CagIFNa蛋白能够在GiCB细胞中实现过表达并分泌到细胞外。pCMV-HA-CagIFNa转染GiCB细胞,研究CagIFNa在细胞水平上的抗病毒能力,结果显示:CagIFNa能够显著减弱由CyHV-2感染引起的细胞病变效应,并且使病毒滴度在感染后24 h、48 h和120 h分别比相应对照组下调6.8倍、18.6倍和69.2倍;同时,荧光定量PCR检测结果显示,过表达CagIFNa的细胞在感染CyHV-2后,病毒基因CTP、MCP和TK的表达量与对照组相比均显著降低。CagIFNa表现出显著的抑制病毒复制的能力。5.CagIFNa激活IFN-I系统相关基因表达的研究荧光定量PCR检测结果显示:过表达CagIFNa的GiCB细胞在感染CyHV-2后,细胞中IFN-I系统相关基因包括IRF3、IRF7、IRF9、STAT1、Mx1和PKR的表达量相较于对照组均显著上调。CagIFNa可以有效诱导IFN-I系统相关基因的表达,促进宿主抗病毒免疫应答的激活。
【学位单位】：华中农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S943
【部分图文】：

硬骨鱼类,信号转导通路,I型

图 1.1 硬骨鱼类 I 型干扰素抗病毒信号转导通路 (Zhu et al 2013)Fig. 1.1 Diagram of the anti-virus signaling of type I IFNs in teleost fish (Zhu et al 2013) 硬骨鱼类 I 型干扰素抗病毒功能及其应用IFN-I 的功能在哺乳动物中已经得到了较为充分的研究，其中 IFN-I 功能主要包括：抗病毒、免疫调节、抑制细胞增殖与抗肿瘤以及诱导细胞凋亡等前针对硬骨鱼类 IFN-I 的研究主要是鉴定了其抗病毒功能，也有少量研究报 IFN-I 的免疫调节功能，而针对鱼类 IFN-I 其它功能的研究却鲜有报道。1 I 型干扰素抗病毒功能在哺乳动物中实际上只有 IFN-I 和 IFN-III 真正发挥先天性抗病毒作用，将它

异育银鲫,病鱼,坏死症,造血器官

2.2 临床症状及病理特征异育银鲫患疱疹病毒造血器官坏死症后临床症状表现为：呼吸急促、嗜睡、食欲不振、离群独游 (罗丹 2014；田飞焱等 2012)。如图 1.2 所示，病鱼眼球突出，鳃部严重坏死，鳃丝肿胀并且有充血或出血的现象，鳃小片糜烂融合，病鱼体表和鳍条基部有出血点，肛门红肿，腹部肿大甚至有些病鱼直肠从腹部漏出；解剖病鱼后，可以看到脾脏和肾脏有不同程度的肿胀和出血，鳔的表面有点出血(Jeffery et al 2007; Whittington and Chong 2007; 林秀秀等 2016)。组织学检查显示患鲤造血器官坏死症的鲫鱼肾脏、脾脏、肝脏和鳃组织有系统性的炎症反应，包括血细胞浸润，细胞核肥大，染色质边集化，组织上皮细胞脱落、空泡变性和局灶性坏死 (Ding et al 2014)。

氨基酸序列,氨基酸序列,核苷酸序列,氨基酸

华中农业大学 2019 届硕士研究生学位论文CagIFNa 基因 cDNA 序列全长为 724 bp (Genbank 登录号：MK093763)，序列中包含长度为57 bp的 5' UTR，115 bp 的 3' UTR和 552 bp 的开放阅读框 (ORF,open reading frame)，使用 ExPASy 预测 CagIFNa ORF 可编码长度为 183 个氨基酸 (aa, amino acid) 的多肽链 (图 2.1)。预测 CagIFNa 蛋白质分子量为 21.943kDa，理论等电点为 9.23。使用 SignalP 程序分析 CagIFNa 氨基酸序列，其 N 端前 23 个氨基酸被鉴定为信号肽序列。

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