水体铜暴露对鲤肠道微生物群落结构及机体脂代谢的影响

发布时间：2020-09-30 18:19

　　集约化养殖模式下,养殖鱼类经常出现肝脂代谢紊乱等问题。鲤是我国北方地区的主养经济鱼类。近年来,由于养殖水体恶化、养殖密度过大等原因,鲤鱼养殖中出现了脂肪过度蓄积等代谢紊乱现象。在众多环境因子中,铜作为矿物营养素、除藻剂或病原菌抑制药物常被过量应用于饲料或水环境中,当其以自由金属离子形式进入到环境中并达到一定浓度时,就会对鱼类等水产动物产生毒害作用。本研究采用高通量测序技术,探究水体铜暴露条件下鲤肠道微生物群落组成及多样性变化,借助荧光定量技术检测鲤肝胰脏脂代谢相关基因及肠道紧密结合蛋白基因表达量的变化,阐述“铜—肠道微生物—脂代谢”三者之间的互作关系,推测肠道微生物介导的铜致机体脂代谢异常的机制。研究结果可为深入揭示鱼类肝脂代谢紊乱机制提供新的视角,为维持鱼类肠道健康、提升水产动物健康养殖水平提供理论依据。1.水体铜暴露对鲤生长性能的影响及在鲤组织中的蓄积根据鲤Cu~(2+)半致死浓度(LC50=1.42 mg/L),本研究共设计1个对照组和3个处理组(浓度分别为0.00 mg/L、0.07 mg/L、0.14 mg/L、0.28 mg/L)。饲喂鲤56 d后,检测鲤的生长指标,结果表明,与对照组相比,处理组的增重率(Weight gain rate,WGR,%)与特定生长率(Specific growth rate,SGR,%/day)均无显著差异(P0.05)。但处理组之间差异显著,即高浓度组的增重率和特定生长率显著低于低浓度组(P0.05)。利用原子吸收光谱法检测铜在鲤肝胰脏和肠道中的累积情况,可以看出,随着处理浓度的增大,铜在鲤肝胰脏和肠道内的累积倍增。用全自动生化分析仪检测血清中总蛋白(Total protein,TP)、高密度脂蛋白(High-density lipoprotein,HDL)、低密度脂蛋白(Low-density lipoprotein,LDL)、甘油三酯(Triglyceride,TG)、免疫球蛋白A(Immunoglobulin A,IgA)和免疫球蛋白G(Immunoglobulin G,IgG)的含量和谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase,ALT)、谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase,AST)、碱性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)等的活性,结果显示,在处理组之间,ALT、LDL、TG、IgG等指标出现显著异常(P0.05)。2.荧光定量检测鲤肝胰脏和肠道脂代谢相关基因的表达量采用实时荧光定量技术检测了5种脂代谢相关基因的表达量,结果显示,与对照组相比,高浓度组脂肪合成相关基因FAS、SREBP-1、ACC-1的表达量呈现显著下调趋势(P0.05),而脂肪分解相关基因LPL、CPT-1的表达量则呈现显著上调趋势(P0.05)。说明处理组脂肪合成减少,脂肪分解增多。同时,检测肠道3种肠粘膜紧密结合蛋白基因Zo-1、Occludin和Claudin-3的表达量,结果发现,与对照组相比,铜处理组Zo-1基因的表达量变化不显著(P0.05),Occludin和Claudin-3基因的表达量出现显著下调的趋势(P0.05)。这预示着肠壁通透性增大,利于肠道内代谢产物进入血液。机体内存在肠-肝轴,正常情况下,肠粘膜可允许少量内毒素(LPS)进入门静脉,维持肝脏网状内系统处于激活状态。如果肠粘膜屏障功能丧失,肠壁通透性就会增高,引起大量细菌和LPS易位,可能会造成肝脏的免疫功能受损,形成慢性肝损伤。3、高通量测序检测肠道微生物群落组成及多样性的变化采用Illumina HiSeqTM 2500测序平台对样品测序完成后,共得到原始序列838,774条。筛选过滤后,12个样品共得到高质量序列721,786条。分析得到29,951个OTU,每个OTU代表一个种系型,此结果说明样品的总体物种多样性水平较高。ACE值、Chaol值、Shannon指数、Simpson指数结果显示,水体铜暴露后,鲤肠道微生物多样性和物种丰富度无显著差异(P0.05)。在门一级水平上,所有序列共被注释到了58个门,主要包括是:变形菌门(Proteobacteria,51.73%),梭杆菌门(Fusobacteria,10.97%),拟杆菌门(Bacteroidetes,5.24%),厚壁菌门(Firmicutes,4.76%),蓝藻菌门(Cyanobacteria,4.24%),放线菌门(Actinobacteria,3.02%),疣微菌门(Verrucomicrobia,2.25%),酸杆菌门(Acidobacteria,2.69%),TM6(2.16%),芽单孢菌门(Gemmatimonadete,1.11%),还有一些其它的微生物类群(8.47%)。根据其在各样品所占比例变化可以看出,在门水平上,与脂代谢相关的微生物出现显著变化,即与对照组相比,低浓度组梭杆菌门(Fusobacteria)的比例显著升高(P0.05);高浓度组厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)的比例显著降低(P0.05)。
【学位单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

字母表示,肝胰脏,中数,差异显著

图 3-1 实时荧光定量检测鲤肝胰脏脂代谢相关基因的表达量图中数据以 mean ± SE 表示（n=3），不同字母表示差异显著（P<0.05）。Fig. 3-1 qRT-PCR analysis of gene expression of lipid metabolism-related genes in liverError bars indicate the mean and standard error (n=3). Different letters indicate statistical difference(P<0.05).

字母表示,蛋白基因,紧密结合,肠道

图 3-2 实时荧光定量检测鲤肠道紧密结合蛋白基因的表达量图中数据以 mean ± SE 表示（n=3），不同字母表示差异显著（P<0.05）。Fig. 3-2 qRT-PCR analysis of gene expression of tight binding protein genes in intestineError bars indicate the mean and standard error (n=3). Different letters indicate statistical difference(P<0.05).

流程图,测序,流程图,DNA样品

图 4-1 Illumina HiseqTM2500 测序流程图Fig. 4-1 Flow chart of Illumina HiseqTM2500 sequencing（1）DNA 样品的检测对 DNA样品的检测主要包括以下 3种方法：

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