鲤鱼HSP70、90真核表达产物对KHV核酸疫苗pIRES-ORF81免疫效果的影响

发布时间：2020-10-02 09:58

　　热休克蛋白(Heat shock protein,HSP)是一种应激蛋白,在外界环境刺激下产生的。按其分子大小可分为多个家族,分别具有不同的生物学特性。其中,HSP70和HSP90家族,均已报道具有分子伴侣的功能,在机体中提呈抗原而提高免疫效果,帮助蛋白完成正确的空间构象,对新生肽链具有识别、折叠、装配、运转、成熟等功能。对细胞具有抗凋亡、促增殖的作用。锦鲤疱疹病毒(Koi Herpesvirus,KHV)能够引发鲤鱼发生高致病性的锦鲤疱疹病毒病(Koi Herpesvirus Diease,KHVD),病毒传播迅速,致死率极高。世界动物卫生组织(OIE)已经将KHVD列为必需报告的疾病。在以往的研究中,多个开放阅读框已经被成功克隆,且被证实具有一定的免疫原性,但免疫效果一直没有很好的突破。因此,探索一种高免疫效果的疫苗已经迫在眉睫。本研究根据Genebank登录的HSP70与HSP90 cDNA序列,利用Primer Premiers 5.0软件设计两对特异性引物,通过PCR克隆获得了240 bp的HSP70基因和687 bp的HSP90基因。将两段基因分别插入到pMD19-T载体中,通过PCR和双酶切鉴定后,确定克隆质粒pMD19-T-HSP70、pMD19-T-HSP90构建成功。经生物公司测序,结果表明,克隆获得的基因片段与鲤鱼HSP70与HSP90同源性达99%。分别将两段基因与表达载体pEGFP-C1连接,经PCR和双酶切鉴定,成功构建重组表达质粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90。将两种重组表达质粒与不同剂量的转染试剂EndoFectionTM Max混合后转染鲤鱼肌肉细胞,通过荧光倒置显微镜观察,重组表达质粒pEGFP-C1-HSP70和pEGFP-C1-HSP90在细胞中成功表达。以多种免疫剂量的重组表达质粒与pIRES-ORF81混合对鲤鱼进行肌肉注射,每周免疫一次,共免疫三次,免疫前采血,收集血清,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测抗体水平。结果表明:于第三次免疫后两周,抗体水平达到最高,联合免疫与单独免疫pIRES-ORF81相比,抗体水平明显升高,但差异不显著。攻毒实验结果显示:与单独免疫核酸疫苗组相比,联合免疫组保护率相对较高。通过病理组织切片观察,单独免疫核酸疫苗组与联合免疫组均未发现明显病理变化。
【学位单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S943
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章前言
    1 热休克蛋白的研究进展
    2 锦鲤疱疹病毒的研究进展
    3 绿色荧光蛋白
    4 本研究的目的与意义
第二章鲤鱼HSP70、HSP90基因的克隆与真核表达载体的构建
    1 材料和方法
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
    5 小结
第三章真核表达质粒PEGFP-C1-HSP70和PEGFP-C1-HSP90免疫佐剂效果的研究
    1 材料
    2 方法
    3 结果
    4 讨论
    5 小结
结论
参考文献
作者简介
致谢

【相似文献】