日本囊对虾ATP合酶及其抑制因子在病毒免疫反应中的功能研究

发布时间：2020-10-08 18:00

　　线粒体ATP合酶产生的ATP是细胞绝大多数生命活动的能量来源,对真核生物的生存至关重要。可是截止到目前,ATP合酶在日本囊对虾先天免疫中的作用还不明朗。本论文主要研究线粒体ATP合酶相关的四种smORF-s在日本囊对虾病毒免疫反应中的功能。日本囊对虾ATP合酶抑制因子1被WSSV利用以帮助其复制MjATPIF1是一种天然的ATP合酶抑制蛋白。它可以通过调节ATP合酶的活性来改变细胞的生理状态。然而截止到目前,MjATPIF1在对虾免疫方面发挥的功能尚未被确定。在本研究中,我们从日本囊对虾中筛选到一种小开放阅读框为ATP合酶抑制因子1,并命名为对虾ATP合酶抑制因子1(MjATPIF1),其开放阅读框包含315个核苷酸,编码104个氨基酸。MjATPIF1在转录水平和蛋白水平均广泛分布于日本囊对虾的多种免疫相关组织中。表达模式阐明病毒刺激后MjATPIF1在血细胞和肠中呈现上调表达趋向。过表达(重组蛋白注射)以及RNA干扰实验表明MjATPIF1有利于白斑综合征病毒在日本囊对虾体内拷贝数的增加。线粒体超氧化物检测表明,MjATPIF1可以促进线粒体超氧化物(SOD)的产生。免疫细胞化学实验结果显示,MjATPIF1能够通过产生SOD提高NF-κB活性进而增进白斑综合征病毒拷贝数的增加。而ATP检测结果表明,MjATPIF1通过改变细胞呼吸类型促进病毒复制和翻译。所有实验结果均表明,MjATPIF1在对虾体内被WSSV利用而有利于病毒复制。因此,WSSV能挟持对虾的ATP合酶抑制因子1增进其在对虾体内拷贝数的增加。日本囊对虾三种ATP合酶亚基有利于WSSV复制我们在日本囊对虾的转录组中筛选到三个小开放阅读框,分别命名为ATP合酶亚基E(MjATP5I)、ATP合酶亚基G(MjATP5L)以及ATP合酶亚基ε(MjATP5E),它们都是F1Fo-ATP合酶的亚基,与其他的ATP合酶亚基共同组成F1F0-ATP合酶。ATP合酶在氧化磷酸化途径中合成ATP的动力来源是质子梯度势。可是关于这三种ATP合酶亚基在免疫方面的功能还不是很清楚。我们分析了三个ATP合酶亚基MjATP5I,MjATP5L和MjATP5E在日本囊对虾病毒免疫反应中的功能。完整的MjATP5I开放阅读框序列一共有258个碱基对,编码85个氨基酸;;MjATP5L的序列全长为300个碱基对,编码99个氨基酸;MjATP5E的开放阅读框含1168对碱基,编码55个氨基酸。在转录水平上,这三个ATP合酶亚基广泛分布于多个免疫组织中。而WSSV刺激的表达模式检测指出,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E在血细胞和肠中均表现上调趋向。而过表达(注射重组蛋白)实验和RNA干扰实验指出,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E都有利于白斑综合征病毒在日本囊对虾体内拷贝数的增加。这些实验结果表明,MjATP5I、MjATP5L和MjATP5E在对虾中可促进WSSV复制,而其具体机制还有待于进一步研究。
【学位单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S945.4
【部分图文】：

物种,序列分析,硕士学位论文,南美白对虾

山东大学硕士学位论文逡逑图２．１．邋Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ的序列分析。Ａ．邋ＭｙＡＴＰＩＦｌ的核酸序列和氨基酸序列。下划线处是ＭｙＡＴＰＩＦｌ逡逑的最小抑制序列。同时也是＾＾／义丁？１？１１１１１１被突变掉的区域。Ｂ．ＭｙＡＴＰＩＦｌ的结构域分析。Ｃ．逡逑不同物种之间ＡＴＰＩＦ１的序列分析。其中包括人、小鼠、南美白对虾和日本囊对虾。背景颜逡逑色代表序列保守程度。逡逑Ｆｉｇ．２．１．邋Ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ａ／／ＡＴＰＩＦ１．邋Ａ．邋Ｎｕｃｌｅａｒ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎｄ邋ａｍｉｎｏ邋ａｃｉｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆ逡逑Ｍ／＇ＡＴＰＩＦｌ．邋Ｔｈｅ邋ｕｎｄｅｒｌｉｎｅ邋ｉｓ邋ｓｍａｌｌｅｓｔ邋ｉｎｈｉｂｉｔｅｄ邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ｏｆＷ／＇ＡＴＰＩＦｌ邋ａｎｄ邋ｍｕｔａｔｅｄ邋ｉｎＭ／ＡＴＰＩＦ邋１邋ｍｕ逡逑Ｂ．邋Ｄｏｍａｉｎ邋ａｎ邋ａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ZfＡＴＰＩＦ１．邋Ｃ．邋ＡＴＰＩＦ１邋ｓｅｑｕｅｎｃｅ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ｄｉｆｆｅｒ邋ｅｎｔ邋ｓｐｅｃｉｅｓ．邋Ｉｔ邋ｈａｓ逡逑Ｈｏｍｏ—ｓａｐｉｅｎｓ，邋Ｍｕｓ一ｍｍｃｕｌｕｓ

效果检测,过表达,重组蛋白,对虾

对ＡＴＰＩＦ１过表达后表达量上升逡逑为了探究kxＡＴＰＩＦ１在ＷＳＳＶ感染对虾时的作用，通过ＲＮＡｉ将逡逑干扰（图２．４Ａ和Ｂ），然后注射ＷＳＳＶ到日本囊对虾中，提取ＲＮＡ检测ＩＥ１和逡逑ＶＰ２８的表达。结果显示，在血细胞和肠中都被干扰掉，而被ＷＳＳＶ逡逑感染后２４ｈ和４８ｈ发现ＩＥ１和ＶＰ２８基因的表达显著下降（图２．５Ａ－Ｄ），进一步逡逑的死亡率实验表明，干扰后的对虾存活率显著升高（图２．６Ａ）。逡逑将ｒｉ＾ＡＴＰＩＦｌ和ＷＳＳＶ的混合物注射进日本囊对虾体内，在血细胞中可以逡逑检测到１＊kx＿八丁？吓１邋（图２．４Ｃ），表明重组蛋白质ｒ＾／ＡＴＰＩＦｌ可以进入细胞。在病逡逑毒感染２４ｈ和４８ｈ后检测ＩＥ１和ＶＰ２８的表达量，结果显示，ZfＡＴＰＩＦ１蛋白质逡逑过表达之后，不论是ＩＥ１还是ＶＰ２８的表达量在血细胞和肠中均显著升高（图逡逑２．５Ｅ－Ｈ）

过表达,检测分析,效果检测,对照组

■■■ＳＡ逡逑Ｉｒ／Ｗ／ＡＴＰＩＦＩ逡逑图２．４．的ＡＴＰＩＦ丨的ＲＮＡｉ和过表达（注射重组蛋白）效果检测。被１＾八丨后，逡逑血细胞中的检测分析。办ＧＦＰ为对照组。Ｂｊ＾ｒＰ／Ｆ／被ＲＮＡｉ后，肠中的场＾７７７７＝７逡逑检测分析。对照组为出ＧＦ／＞。Ｃ．场ＡＴＰＩＦ１过表达后１邋ｈ，用荧光显微镜检测ｒＡ々＿ＡＴＰＩＦｌ在血逡逑细胞中的定位，鼠抗Ｈｉｓ抗体作为一抗，并且将抗鼠的ＦＩＴＣ作为二抗。ＢＳＡ作为对照组。逡逑（＊ｐ＜０．０５）逡逑Ｆｉｇ．２．４．邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＮＡｉ邋ａｎｄ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｉｎｊｅｃｔｅｄ）邋ｏｆ逡逑Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ．邋Ａ．邋Ｔｈｅ邋ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ逦ｉｎ邋ｈｅｍｏｃｙｔｅ邋ａｎｄ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ邋ａｆｔｅｒ邋ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ邋ｏｆ逡逑ＭｊＡＴＰＩＦＬ邋Ｔｈｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｉｓ邋ｄｓＧＦＰ．邋Ｂ．邋Ｔｈｅ邋ＲＮＡｉ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＭｊＡＴＰＩＦｌ邋ｉｎ邋ｉｎｔｅｓｔｉｎｅ．邋Ｃ．邋Ａｆｔｅｒ邋Ａ＾／ＡＴＰＩＦｌ逡逑ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｎｅ邋ｈｏｕｒ，邋ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ邋ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ邋ｗａｓ邋ｕｓｅｄ邋ｔｏ邋ｌｏｃａｔｅ邋ｒＡ／／ＡＴＰＩＦｌ邋ｉｎ邋ｎｕｃｌｅａｒ．邋Ｔｈｅ逡逑２４逡逑

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