弧菌攻毒模型及凡纳滨对虾肠道对哈氏弧菌侵染的生理、免疫反应研究

发布时间：2020-10-10 23:40

　　 弧菌广泛分布于海水养殖环境内,在水产养殖中,弧菌一直被认为是很多海洋鱼类或无脊椎动物特别是虾的主要致病菌。凡纳滨对虾是世界对虾养殖的主要经济品种,随着对虾养殖规模的快速发展,养殖环境日益恶化,由弧菌引发的对虾疾病,影响对虾的生长繁殖,引起对虾的大量死亡,已经在全球范围内造成了重大经济损失,成为对虾养殖产业发展的主要制约因素。解决病害问题需要从病原感染机理等研究入手。本研究共分为两个部分：第一部分基于Cox比例风险模型,探究哈氏弧菌不同菌株、剂量及感染方式对凡纳滨对虾的攻毒效果的影响。目前相当多的研究揭示了许多因素影响弧菌病的爆发,其疾病动态发展机制亟需探讨。很多学者针对弧菌与对虾死亡的相互作用展开研究,这对如何有效控制攻毒试验的风险因素极为重要。在本研究中,Cox比例风险模型首次应用于水产动物疾病学研究,有效分析了在弧菌的攻毒试验中对虾动态生存情况,并定量描述了弧菌风险因素的影响。预后指数的建立也为今后攻毒试验选择条件提供了指导。主要结果如下：1.采取log-rank检验方法对不同弧菌攻毒浓度、不同侵染途径及不同弧菌菌株作用下的对虾生存期进行比较,高浓度弧菌攻毒(108cfu/mL)较低浓度弧菌攻毒(107cfu/mL),在更短时间内引起了对虾持续大量的死亡现象(P=0.038)；注射攻毒比浸浴攻毒能够更有效地引发弧菌感染(P0.05)；相比菌株Vp,菌株Vh对对虾生存期缩短有更大的影响(P=0.042)。2.注射攻毒导致对虾死亡的风险是浸浴攻毒的40.4倍(HR=40.4；P=0.000)。高浓度弧菌攻毒组(108cfu/mL)对低浓度弧菌攻毒组(107 cfu/mL)死亡风险比为5.9(HR=5.9,P 0.000)。Vh毒力较强,是Vp毒力的4.8倍(HR=4.8,P0.000)。3.在对虾攻毒试验中,侵染方式因素对对虾生存时间影响最大(β=3.698,P0.05),攻毒剂量因素次之(β=1.778,P0.05),弧菌菌株因素影响最小(β=1.561,P0.05).第二部分研究针对凡纳滨对虾肠道对哈氏弧菌浸浴的组织病理变化及转录水平的免疫应答。通过组织切片探究对虾肠道组织形态在不同浓度哈氏弧菌(低浓度组1.05×105cfu/mL,中浓度组1.05×106cfu/mL及高浓度组1.05×107cfu/mL)的浸浴攻毒作用下的动态变化,采用实时荧光定量PCR测定抗脂多糖因子基因(ALF)、对虾素基因(Pen-4c)和Crustin基因(Cru)以及溶菌酶基因(LZM)、脂肪酸结合蛋白基因(Fabp)等免疫相关基因的表达水平变化,并对肠道及水体中的弧菌数目及分布情况进行监测。主要结果如下：1.浸浴攻毒是弧菌侵染对虾肠道并引发感染的有效方式。对虾肠道的感染程度可分为轻度感染及重度感染。轻度感染主要发生于低中浓度组的中后期及高浓度组侵染早期,上皮细胞形态发生改变,黏膜层开始与固有层分离。重度感染主要发生于低中浓度组后期及高浓度组中期,上皮细胞完全溃散并脱落,肌层也发生损伤。随着弧菌浓度的提高和攻毒时间的延长,中肠组织损伤情况逐渐加重。攻毒后40h内,对虾肠道组织形态持续恶化,未见组织修复。2.肠道受到哈氏弧菌侵染后8-16h,ALF、Pen、Cru及LZM表达量能够迅速上调,32h后均回落至初始水平(P0.05)。Cru在哈氏弧菌侵染作用下表达量变化最大。Fabp基因32h内各攻毒剂量组表达情况未有极大波动,基本较对照组维持在2-6倍的表达水平,并且总体上并无显著提高(P0.05)。3.攻毒后,三种攻毒浓度组水体中弧菌均处下降趋势,未出现弧菌大规模增殖的现象。在32h后,低、中、高浓度组无显著性差异并普遍趋于稳定：低、中、高攻毒组中,对虾肠道弧菌在0-8h通过水浴攻毒方式经口传播大量进入对虾肠道,8h-24h维持稳定,16h后肠道弧菌小量下降至32h菌数回落。
【学位单位】：中国科学院研究生院(海洋研究所)
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S945.49
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 绪论
    1.1 海洋弧菌研究进展
        1.1.1 弧菌简述
        1.1.2 弧菌病原种类
        1.1.3 对虾弧菌病的爆发
    1.2 弧菌与对虾相互作用
        1.2.1 弧菌侵染
        1.2.2 对虾防御机制
    1.3 攻毒模型研究
        1.3.1 攻毒剂量的影响
        1.3.2 侵染途径的影响
        1.3.3 攻毒菌株的影响
        1.3.4 Cox比例风险模型的应用
    1.4 对虾肠道免疫及哈氏弧菌引发的肠道损伤研究
        1.4.1 哈氏弧菌
        1.4.2 哈氏弧菌致病机理
        1.4.3 哈氏弧菌致病症状
        1.4.4 弧菌侵染对虾肠道研究进展
    1.5 对虾组织损伤及修复机制
    1.6 本研究内容和意义
        1.6.1 研究内容
        1.6.2 研究意义
    参考文献
第二章 基于COX比例风险模型探究弧菌侵染凡纳滨对虾的影响因素
    2.1. 材料与方法
        2.1.1 实验仪器
        2.1.2 培养基及试剂
        2.1.3 菌种与培养
        2.1.4 试验用虾及饲养管理
        2.1.5 攻毒实验
        2.1.6 统计分析
    2.2. 结果分析
        2.2.1 数据准备及加工
        2.2.2. 变量PH假定(proportional hazards assumption)分析
        2.2.3. 变量的显著性检验
        2.2.4. Kaplan-Meier生存曲线
        2.2.5. Cox比例风险模型回归分析
    2.3. 讨论
        2.3.1. Cox比例风险模型在水产方面的应用前景
        2.3.2. 风险因素对对虾生存时间的影响
        2.3.3. 预后指数的建立
    2.4 结论
    参考文献
第三章 凡纳滨对虾肠道对哈氏弧菌浸浴的组织病理变化及转录水平的免疫应答
    3.1. 材料与方法
        3.1.1 实验仪器
        3.1.2 培养基及试剂
        3.1.3 菌种与培养
        3.1.4 试验用虾及饲养管理
        3.1.5 攻毒实验及取样
        3.1.6 组织切片制作及观察
        3.1.7 肠道总RNA提取
        3.1.8 实时荧光定量PCR分析基因表达
        3.1.9 统计分析
    3.2 结果与分析
        3.2.1 组织学分析
        3.2.2 哈氏弧菌攻毒后相关基因表达
        3.2.3 水体及肠道中的弧菌数目变化
    3.3 讨论
        3.3.1 对虾肠道组织损伤及修复
        3.3.2 对虾肠道免疫基因表达
        3.3.3 对虾肠道及水体弧菌数量变化
    3.4 结论
    参考文献
致谢
硕士期间发表期刊及论文
作者简历

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本文编号：2835711