新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产致病菌
发布时间：2020-10-11 12:16
我国是世界水产养殖大国,养殖规模位居世界前列。但目前的高密度集约化养殖使得病害发生日益频繁,尤以细菌病最为严重,传统的荧光抗体法、酶联免疫分析法均存在背景荧光较高,灵敏度低等缺陷,时间分辨荧光免疫分析法作为一种高灵敏的检测方法已在食品、化学等领域引起重视;课题组首次应用时间分辨荧光免疫分析法检测了产酸克雷伯氏菌,我们在此基础上探索了TRFIA检测致病菌的新方法,主要内容如下:1.建立了双标记TRFIA检测嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12,将致病菌直接包被微孔板,Eu3+-Ig G、Sm3+-Ig G作为检测抗体对其进行检测,嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12检测灵敏度均为1.0×106 cfu/m L,灵敏度较低存在很大的可拓展空间。2.为了进一步提高检测灵敏度,将抗嗜水气单胞菌B18抗体和抗产酸克雷伯氏菌B12抗体包被微孔板,建立了嗜水气单胞菌B18和产酸克雷伯氏菌B12的双抗夹心双标记TRFIA法,通过对包被Ig G、Eu3+-Ig G及Sm3+-Ig G进行优化产酸克雷伯氏菌B12的检测限达到1.0×104 cfu/m L,嗜水气单胞菌B27的检测限为6.0×104 cfu/m L,标准曲线在1.0×104-1.0×107cfu/m L范围内线性良好,相关系数达99%以上,均优于目前常用的荧光抗体法及ELISA法,且特异性好、重复性好、亦可用于实际样品检测。3.利用生物素标记抗嗜水气单胞菌抗体,碱性磷酸酶标记的链霉亲和素与其发生特异反应后,先后加入反应底物二氟苯水杨酸酯,在酶催化作用下,反应产物能够与Tb3+-EDTA生成时间分辨荧光溶液,以此建立的酶放大时间分辨荧光分析法检测嗜水气单胞菌B18。标准曲线在1.0×102-1.0×106cfu/m L范围内线性良好,该方法的灵敏度为1.0×102cfu/m L,优于双抗夹心双标记时间分辨荧光免疫分析法,且特异性好,重复性好,可用于实际样品检测。4.本课题组先期已合成出新型螯合剂DTPA-p AS,但直接与抗体标记,灵敏度较低;本研究在此基础上,通过多聚赖氨酸改进标记比,建立了检测嗜水气单胞菌B18的TRFIA法,灵敏度为1.0×105cfu/m L。
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S941
【部分图文】：
学硕士学位论文 新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产26983。数据分析后，产酸克雷伯氏菌的板内变异系数为 6.38%，板间变异；嗜水气单胞菌的板内变异系数为 5.84%，板间变异系数为 8.81%；板内变变异系数均符合小于 15%的要求[100,101]，说明该方法具有高度可重复性，能测。
释到 1×10cfu/mL）注入鳗鲡腹腔，每条鳗鲡注入 0.2mL，对照组理 15 天。15 天后选取无明显发病症状以及略微有患病症状的鳗鲡鲡样品均取其肠、肝、肾、鳃、肌肉等部位组织，置于-80℃冷藏备心双标记 TRFIA 对其进行测定，分别取各部位组织 0.1g，置于 700浆、离心后，取各自上清液等体积混合后，实验组设两组平行，注样品作为对照组，免疫反应后测定并记录 TRF 值。与分析被抗体最适工作浓度示，当包被抗体浓度小于 1 μg/mL，免疫反应随着包被抗体浓度的增等于 1 μg/mL ，TRF 值最大；包被抗体大于 1 μg/mL，TRF 值会出疫反应饱和趋于平稳。达到峰值后出现略微降低主要是因为 IgG 浓子出现多层化，彼此之间的相互作用会影响其与微孔板的吸附性，非特异性吸附以及空间位阻效应。而抗体浓度过小也会导致免疫反上结果，将包被抗体的最适浓度确定为 1 μg/mL。
图 3-2 Eu3+-IgG 的浓度对检测信号的影响图 3-3 Sm3+-IgG 的浓度对检测信号的影响横坐标表示菌浓度的对数值，纵坐标表示时间分辨荧光的对数值，最佳稀释度为 1∶1280横坐标表示菌浓度的对数值，纵坐标表示时间分辨荧光的对数值，最佳稀释度为 1∶600
【参考文献】
本文编号：2836580
【学位单位】：集美大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S941
【部分图文】：
学硕士学位论文 新型时间分辨荧光免疫分析法检测水产26983。数据分析后，产酸克雷伯氏菌的板内变异系数为 6.38%，板间变异；嗜水气单胞菌的板内变异系数为 5.84%，板间变异系数为 8.81%；板内变变异系数均符合小于 15%的要求[100,101]，说明该方法具有高度可重复性，能测。
释到 1×10cfu/mL）注入鳗鲡腹腔，每条鳗鲡注入 0.2mL，对照组理 15 天。15 天后选取无明显发病症状以及略微有患病症状的鳗鲡鲡样品均取其肠、肝、肾、鳃、肌肉等部位组织，置于-80℃冷藏备心双标记 TRFIA 对其进行测定，分别取各部位组织 0.1g，置于 700浆、离心后，取各自上清液等体积混合后，实验组设两组平行，注样品作为对照组，免疫反应后测定并记录 TRF 值。与分析被抗体最适工作浓度示，当包被抗体浓度小于 1 μg/mL，免疫反应随着包被抗体浓度的增等于 1 μg/mL ，TRF 值最大；包被抗体大于 1 μg/mL，TRF 值会出疫反应饱和趋于平稳。达到峰值后出现略微降低主要是因为 IgG 浓子出现多层化，彼此之间的相互作用会影响其与微孔板的吸附性，非特异性吸附以及空间位阻效应。而抗体浓度过小也会导致免疫反上结果，将包被抗体的最适浓度确定为 1 μg/mL。
图 3-2 Eu3+-IgG 的浓度对检测信号的影响图 3-3 Sm3+-IgG 的浓度对检测信号的影响横坐标表示菌浓度的对数值，纵坐标表示时间分辨荧光的对数值，最佳稀释度为 1∶1280横坐标表示菌浓度的对数值，纵坐标表示时间分辨荧光的对数值，最佳稀释度为 1∶600
【参考文献】
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本文编号：2836580
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