长江鲟干扰素通路相关基因的克隆及表达研究

发布时间：2020-10-15 05:03

　　长江鲟(Acipenser dabryanus)是国家一级极度濒危保护动物。近几年虽然长江鲟的人工繁,养殖都取得很大的成功,但是每年都会出现因疾病造成很大损失的情况,因此,免疫防治成为解决该问题的重要切入点。本研究根据长江鲟转录组相关信息,挑选出SIGIRR(Single Ig IL-1R–related molecule)、TRAF6(Tumor necrosis factor receptor-associated factor 6)、Mx(Myxovirus resistance)、Viperin(virus inhibitory protein,endoplasmic reticulum-associated,interferon-inducible)、PKR(Double-stranded RNA-dependent protein kinase)及ADAR(Adenosine deaminase acting on RNA)六个干扰素信号通路中的基因进行研究。在本研究中,我们分别克隆了SIGIRR、TRAF6、Mx、Viperin、PKR及三个ADAR亚型(ADAR1-1,ADAR1-2和ADAR4)基因的cDNA序列,并利用qPCR技术检测这些基因在组织中的表达模式和经Poly(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)诱导后的表达变化。所有结果如下:(1)长江鲟SIGIRR和TRAF6基因的开放阅读框(ORF)长度分别为1641 bp和1668 bp,分别编码546和555个氨基酸。预测的SIGIRR蛋白质的分子量约为58.86 KDa;理论等电点为5.09;不稳定指数为46.64,为不稳定蛋白。而TRAF6的蛋白分子量为62.54 KDa;理论等电点5.64;不稳定指数61.60,也是不稳定蛋白。长江鲟SIGIRR和TRAF6蛋白序列在相似性上,与小体鲟(Acipenser ruthenus)最为相似,分别具有97.70%和98.37%的相似性。长江鲟SIGIRR的蛋白结构具有两个Ig结构和一个TIR结构域,这与小体鲟的同源基因蛋白结构域非常的一致,而TRAF6与其他物种的同源基因蛋白结构域保持高度一致。此外,长江鲟SIGIRR基因含有9个外显子和8个内含子,在不同物种之间通有4个相同大小的外显子,而TRAF6包含3个外显子和2个内含子。SIGIRR和TRAF6在所有检测的组织中都有表达,其中SIGIRR在肠表达最高,在血液表达最低;TRAF6在头肾表达最高,其次是肠,在血液里最低。在使用Poly(I:C)进行模拟感染长江鲟鳍条细胞后,长江鲟SIGIRR在3 h时的表达显著下调(P0.01),在6 h上升恢复到正常水平;长江鲟TRAF6在6 h至24 h持续显著上调。这些结果表明长江鲟SIGIRR和TRAF6可能在长江鲟病毒诱导的TLR信号传导途径中起重要的作用。(2)长江鲟Mx基因序列含有1449 bp长度的ORF,其编码482个氨基酸,以及123 bp的5'非翻译区(UTR)和不完全测序的3'。而Viperin和PKR基因的ORF长度分别为1050 bp和1221 bp,分别编码349和406个氨基酸。虽然长江鲟Mx和其他动物Mx蛋白之间的相似性很低,但长江鲟Mx含有保守的三联GTP结合基序和发动蛋白家族特征。蛋白序列的相似性以及序列多重比较,表明长江鲟Viperin和PKR在物种中相对保守。此外,长江鲟Mx基因具有8个外显子和7个内含子;Viperin含有6个外显子和5个内含子,而PKR拥有13个外显子和12个内含子。在所有检测的组织中都可检测到Mx,Viperin,PKR及ADAR的表达,其分别在皮肤,血液,脑以及肠和皮肤中主要表达。在使用Poly(I:C)进行模拟感染长江鲟鳍条细胞后,Mx,Viperin和PKR在6 h至24 h持续显著上调(P0.05),ADARs也显著变化。这些结果表明,长江鲟Mx,Viperin,PKR和ADAR可能在长江鲟的先天免疫系统中发挥重要的抗病毒作用。
【学位单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

示意图,鱼类,信号通路,示意图

1.2.2 鱼类干扰素信号通路IFN 系统激活的前提是外界的病原微生物与靶细胞的模式识别受体（PRRs，pattern recognition receptors）结合并发生信号转导。TLRs（Toll-like receptors）和RLRs（RIG-I-like receptors）都属于 PRRs。在鱼类中发现了多样化的 TLR 序列[51,52]。一些 TLR 仅在低等脊椎动物中被描述，包括 TLR14 和 TLR23; TLR18， TLR19和 TLR20 ; TLR21 和 TLR22; TLR24，TLR25 及 TLR26[51,53,54]。TLRs 在哺乳动物中参与识别双链 RNA (dsRNA) (TLR3)或单链 RNA (TLR7 和 8)，在鱼类中具有良好的同源性[55]。结构和功能分析均表明这些 TLR 也参与鱼类的病毒感染：所有与dsRNA 结合的关键残基在鱼类 TLR3 中都是保守的[54]，同样，富含亮氨酸的 TLR7重复序列在哺乳动物和鱼类之间非常保守[54,56]，TLR7 和 TLR8（R-848）的已知配体诱导鲑鱼（Salmonidae）白细胞中典型的 IFN 反应[57,58]。此外，在鱼类特异性 TLR中，TLR22 对病毒感染，poly（I:C）和 dsRNA 均有反应[59]。河豚（Takifugu rubripes）的 TLR22 可识别细胞表面的长链 dsRNA，而 TLR3 可识别内质网中的短链 dsRNA[59]，这可能是鱼类 RNA 病毒感染的双重途径。

白细胞介素-1,信号通路,细胞因子

图 1-2 白细胞介素-1 细胞因子家族成员信号通路[77]Fig.1-2 Signaling of IL-1 cytokine family members为 TRAF1 至 7[83]。其中，TRAF6 是 TRAF 家族中独特且研究得很好的成员。在来自各种 PRR 和细胞因子受体（包括 TNF 超家族，TGFβ，IL-1/Toll 样和 NOD 样受体）的信号传导途径中，TRAF6 是必需的信号转导分子[84-86]，而且在 MyD88 依赖性信号传导中也是需要的[87]。在 NF-kB 途径中，TRAF6 作为衔接信号分子，并激活 IκB 激酶（IKK）级联触发转录因子 NF-kB 的激活以响应促炎细胞因子[83]。此外，TRAF6 形成由 Ubc13 和 Uev1A 组成的泛素结合酶复合物，作为 E3 泛素连接酶，催化 TAK1 的 K63 多泛素化，这是 IKK 活化所必需的，并介导其他下游信号分子的激活，从而诱导 IRF7，IRF3 和 NF-κB 的组成性激活[88]。TRAF6 在响应水泡性口炎病毒（Vesicular Stomatitis Virus，VSV）感染和 dsRNA，poly（I:C）的 IFN-α/β产生中表现出不足之处。TRAF6 还通过在感知细胞溶质病毒 RNA 和 DNA 时激活NF-kB 和 IRF7 来建立先天免疫应答[89]。除 TRAF6 在先天免疫中的作用外，TRAF6还在适应性免疫中发挥功能。Pearce 等人对含有 T 细胞特异性 TRAF6 缺失的小鼠进行了研究，结果显示由于缺乏 AMP 激活的激酶激活和生长因子耗尽后的线粒体

蛋白结构,颜色