HD-3复方中草药对凡纳滨对虾免疫酶影响和抗WSSV感染分析

发布时间：2020-10-21 13:10

　　 随着国内外学者对对虾白斑综合征病毒(WSSV)的研究深入,在病原分子基因水平、感染传播和对虾免疫保护方面取得了丰硕的研究成果,但在防控技术上未能获得理想的防治效果。本实验旨在调查了解养殖凡纳滨对虾WSSV检出率和发病情况,应用前期筛选的抗WSSV专用中草药HD-3进行感染临床试验,通过统计分析对虾死亡率和对虾免疫酶活数据,结合荧光定量PCR、组织病理学检测和超微病理学检测,确定投喂中草药的最佳预防方案,并开展中试试验检验生产疗效。1.在2014年7月-2015年12月,对辽宁、河北、天津、山东和浙江五省份,杨家泊、滨州、潍坊、胶南等环黄渤海凡纳滨对虾主产区,共采集29批次样品。每个养殖场样品定义为同一批次,进行WSSV病原携带率和养殖工艺调查。通过DNA提取,利用套式PCR和荧光定量PCR诊断凡纳滨对虾的WSSV阳性率。结果显示,在北方凡纳滨对虾主要产区通过套式PCR方法,WSSV阳性检出率高达72.4%;通过荧光定量方法,WSSV检出率达86.2%。荧光定量检测方法敏感度在101copies/mg优于套式PCR。传统土塘养殖工艺凡纳滨对虾WSSV检出率和感染程度高于大棚养殖和工厂化养殖模式。2.基础饲料添加3%HD-3复方中草药做药饵,每天2次投喂量占对虾体重5%,水体温度25~28℃,盐度18~20‰,溶解氧6.5mg/L以上。投喂1d、4d、7d、10d、13d、16d和19d药饵后进行口服WSSV毒饵感染方式攻毒,统计对虾症状表现和死亡率,测定对虾酚氧化酶(PO)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)四种免疫因子。结果显示:在饲料中添加HD-3中草药,可以起到保护对虾的作用,预防13d、16d和19d在试验结束后仍有存活对虾,其中实验组16d获得最高的免疫保护率,达到36.7±3.3%,存活者健康与空白对照组对虾无异。服用HD-3 10d以后,可以显著提高对虾PO、SO D和AKP活力(P0.05),缓慢提升ACP活力(P0.05)。攻毒后服用较长时间中草药的实验组对虾,PO、SOD、AKP和ACP活力可以获得更持久的免疫活性。3.通过荧光定量对阳性对照组和各实验组不同感染时期凡纳滨对虾腮组织内病毒进行定量分析,显示随着服用中草药时间的延长,对虾体内病毒增长幅度和最大峰值总体上低于阳性对照组。在感染72h后,阳性对照组病毒含量达到106 copies/mg峰值时,服用中草药10d以后实验组病毒含量显著小于阳性对照组(P0.05),仍在104 copies/mg数量级。而存活对虾体内病毒含量整体较低,处于103 copies/mg数量级以下。通过组织病理观察统计细胞核肿大程度(SOI),发现SOI与WSSV感染程度成正比,在腮组织和胃组织内,实验组10d-19d在感染后SOI整体上低于阳性对照组,表现出良好的保护率。并且攻毒后存活对虾SOI大多处于中度感染以下。在超微组织病理分析中,阳性对照组中,腮、胃和甲壳下表皮中受WSSV感染细胞数目和完整WSSV病毒含量明显多于用药组的存活对虾。在用药组中对虾病毒形态多表现为大多数细胞完整,有稀疏、少量的病毒粒子存在,囊膜和核衣壳组装多数不完整,亚细胞器诸如线粒体、内质网等较清晰完整。超微电镜观察结果与荧光定量和SOI结果相符,推测该中草药HD-3对阻断WSSV侵染和细胞内增殖有显著效果。4.将抗WSSV中草药HD-3在WSSV阳性检出的对虾养殖场进行中试试验,试验周期28天。经过整个养殖周期,对虾没有爆发白斑综合征,由统计数据分析显示,抗WSSV中草药实验组显著提高了对虾的增重率和成活率(P0.05)。添加中草药可以在一定程度上提高对虾免疫活力,尤其在高温期,PO和ACP显著高于对照组。通过定量PCR,显示中草药对WSSV有减缓增殖的趋势。
【学位单位】：大连海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S945.4
【部分图文】：

验方法查采样方法 年 7 月~2015 年 12 月期间，对辽宁、河北、天津、山东、江滨对虾养殖区养成期的对虾进行样品采集，总共 29 个样品（养殖池塘、简易养殖大棚、工厂化养殖车间等养殖模式。样个样品 10-30 头，充氧运输至青岛中国水产科学研究院黄海水以供对虾外观病症分析、提取 DNA 之用。定义每次采样中一本，混合 10 尾虾的腮组织保存在液氮中备用。

2.2.1 对虾 WSSV 阳性检测经过对样品进行套式 PCR 发现，在一扩条带中，由图 2-2 和阳性对照中有明显的 1447bp 特异性条带，而其他样品和阴性对照中没有出现条带。说明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度较高。以第一次扩增产物为模板进行第二次扩增 PCR，由图 2-3 显示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 对虾基因组可以扩增出 941bp 的特异性片段。说明这些样品也是 WSSV 感染体，但是感染程度不大，处于较弱感染状态。图 2-4 显示，各样品和阳性样品都扩增出 848bp 的片段，且阴性对照没有条带，阳性对照条带明显，说明各样品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一扩和二扩 PCR 产物中无特异性条带，表现为阴性。

2.2.1 对虾 WSSV 阳性检测经过对样品进行套式 PCR 发现，在一扩条带中，由图 2-2 和阳性对照中有明显的 1447bp 特异性条带，而其他样品和阴性对照中没有出现条带。说明 B1、F1、G3 受 WSSV 感染，而且感染程度较高。以第一次扩增产物为模板进行第二次扩增 PCR，由图 2-3 显示，A1、B1、B3、B4、C1、C2、E1、E2、F1、F2、F3、F5、F6、G1、G3、I1、J1、K1、K2、K4 和 M1 对虾基因组可以扩增出 941bp 的特异性片段。说明这些样品也是 WSSV 感染体，但是感染程度不大，处于较弱感染状态。图 2-4 显示，各样品和阳性样品都扩增出 848bp 的片段，且阴性对照没有条带，阳性对照条带明显，说明各样品都是有效的。B2、D1、F4、G2、G4、H1、K3、L1 在一扩和二扩 PCR 产物中无特异性条带，表现为阴性。
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本文编号：2850158