鱼源无乳链球菌转录组分析及其毒力相关基因筛选和sRNA预测

发布时间：2020-10-22 23:51

　　 无乳链球菌是革兰氏阳性细菌,属于B族链球菌(Group B Streptococcus,GBS),是引起我国南方地区罗非鱼链球菌病的主要病原菌之一。近年来,罗非鱼链球菌病频繁发生,使我国水产养殖业遭受了巨大的经济损失,因此,对无乳链球菌的防治和研究迫在眉睫。研究表明,无乳链球菌的毒力受到温度的调控,在水温超过35℃时能引起罗非鱼链球菌病的暴发和流行。为了研究筛选鱼源无乳链球菌毒力相关基因,以不同温度(25℃和37℃)下培养的无乳链球菌ZQ0910为研究对象,将该菌在25℃和37℃下分别培养至对数生长期,然后对这两个样品进行转录组测序。通过对转录组数据分析筛选无乳链球菌毒力相关基因和预测sRNA;并通过荧光定量PCR技术对筛选得到的毒力相关基因的表达水平进行验证;利用RT-PCR方法对预测的部分sRNA进行验证。其结果为研究鱼源无乳链球菌的毒力基因功能及sRNA的调控机制提供了重要线索。具体研究内容如下:1.将25℃和37℃下分别培养的无乳链球菌样本进行转录组测序分析,结果表明37℃样本(Test)基因表达总数为1929条,25℃样本(CK)基因表达总数是1935条。样品间表达显著差异基因总数为673条,显著上调差异基因146条,显著下调差异基因527条。Pathway富集分析表明,1215条基因注释到KEGG的105条通路上,包含447个显著性差异基因;其中显著富集通路有40条,差异最显著的通路包括代谢相关的通路、生物合成相关通路、修复相关通路和信号通路等。2.从无乳链球菌转录组中筛选到7个毒力相关基因,即cylI、cylA、cylK、cyl J、cylG、sodA和PI-2b。首先,对7个毒力相关基因克隆并进行生物信息分析,然后,利用荧光定量PCR进行验证。结果显示:7个毒力相关基因都能够克隆到全长;7个基因的荧光定量结果与转录组测序结果的表达趋势一致,只是相对表达量的倍数有所差异。总的来说,转录组结果的可靠性较高。3.从无乳链球菌转录组中预测到sRNA 167条,对部分预测的sRNA应用RT-PCR进行验证。结果显示:SAR-1、SAR-9、SAR-4、SAR-14、SAR-T克隆获得的片段长度分别是178bp、139bp、110bp、165bp、111bp,而且,克隆获得的基因片段都能够完全比对到各自预测的sRNA序列上。说明这几个sRNA存在于无乳链球菌ZQ0910。
【学位单位】：广东海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S943
【文章目录】：
摘要
Abstract
1 前言
    1.1 无乳链球菌国内外研究进展
        1.1.1 无乳链球菌的特点
        1.1.2 无乳链球菌致病性的研究进展
    1.2 链球菌属sRNAs的研究
        1.2.1 链球菌属中预测和鉴定sRNAs的方法
        1.2.2 链球菌sRNAs的多样性
        1.2.3 链球菌属调控网络中的sRNAs
    1.3 本研究的目的及意义
2 无乳链球菌ZQ0910转录组测序分析
    2.1 实验材料
        2.1.1 菌株
        2.1.2 主要仪器
        2.1.3 主要溶液和培养基
    2.2 实验方法
        2.2.1 无乳链球菌ZQ0910生长曲线的制作
        2.2.2 菌株活化及培养
        2.2.3 取菌送测
        2.2.4 测序数据分析
        2.2.5 比对统计
        2.2.6 基因统计
        2.2.7 基因注释及功能预测
        2.2.8 sRNA预测
    2.3 结果
        2.3.1 无乳链球菌ZQ0910总RNA质量检测
        2.3.2 无乳链球菌ZQ0910转录组测序结果
        2.3.3 样品间差异分析结果
        2.3.4 样品间差异基因注释及功能预测
    2.4 讨论
3 无乳链球菌ZQ0910毒力相关基因的克隆和验证
    3.1 实验材料
        3.1.1 菌株和质粒
        3.1.2 主要试剂
        3.1.3 主要仪器
        3.1.4 主要溶液和培养基
    3.2 实验方法
        3.2.1 无乳链球菌ZQ0910的培养
        3.2.2 无乳链球菌ZQ0910总RNA的提取
        3.2.3 总RNA反转录成cDNA
        3.2.4 毒力相关基因的克隆
        3.2.5 毒力相关基因的验证
    3.3 结果
        3.3.1 cylA基因的克隆与分析
        3.3.2 cylG基因的克隆与分析
        3.3.3 cylI基因的克隆与分析
        3.3.4 cylJ基因的克隆与分析
        3.3.5 cylK基因的克隆与分析
        3.3.6 sodA基因的克隆与分析
        3.3.7 PI-2b基因的克隆与分析
        3.3.8 荧光定量验证结果
    3.4 讨论
4 无乳链球菌ZQ0910 sRNA的验证
    4.1 实验材料
        4.1.1 菌株和质粒
        4.1.2 候选sRNA序列
        4.1.3 主要试剂
        4.1.4 主要仪器
        4.1.5 主要溶液和培养基
    4.2 实验方法
        4.2.1 无乳链球菌ZQ0910总RNA的提取
        4.2.2 总RNA反转录成cDNA
        4.2.3 sRNA的RT-PCR
    4.3 结果
        4.3.1 无乳链球菌ZQ0910总RNA的提取
        4.3.2 无乳链球菌ZQ0910 cDNA模板合成
        4.3.3 sRNA SAR-1、SAR-9、SAR-4、SAR-14、SAR-T克隆结果与分析
    4.4 讨论
5 结论
参考文献
致谢
作者简介
导师简介

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本文编号：2852248