红鲫体色发育的分子调控机制研究

发布时间：2020-10-26 01:56

　　 红鲫因其拥有鲜艳的红色体色而备受人们喜爱,是具有重要观赏价值的观赏鱼品种之一。然而,红鲫在体色发育过程中存在“青转红”的现象,即黑色素细胞先增加后减少,体色由青灰色转变为红色的现象。探究这种“青转红”现象的遗传分子调控机制,有利于人们更好地理解黑色素细胞发育的分子遗传机理。因此,本研究利用转录组高通量测序技术检测了红鲫不同体色发育时期皮肤组织中基因表达信息,通过高通量测序技术结合MethylRAD甲基化测序技术研究了成体红鲫与白鲫皮肤组织中基因表达信息和DNA甲基化位点信息,同时利用了 CRISPR/Cas9基因敲除技术和过表达质粒载体构建技术探究了体色发育相关基因的具体功能。具体研究结果如下:1.通过组织学观察技术,我们跟踪研究了红鲫体色发育的各个时期中色素细胞的组成和变化情况,发现黑色素细胞最早出现在受精后48h(hpf),孵化出膜后1天(ldph)时黄色素细胞在头部出现,7dph左右虹彩细胞在腹部少量出现;胚胎及幼苗红鲫体表黑色素细胞逐渐增多,45～60d左右红鲫体表黑色素细胞开始凝集减少,大约在90d左右黑色素细胞完全消褪,此时黄色素细胞与红色素细胞逐渐增多,最后红鲫通体呈现出红色体色。2.通过RNA-Seq技术首次获得了红鲫变色前(GC)、变色中(CV)和变色后(RC)这三个不同体色发育阶段的转录组信息,分别得到了103,229、108,208和120,184个转录本。通过SNP序列分析,分别得到了 187,616、191,213和218,780个SNP位点。通过生物信息学分析显示,在CV和GC、RC和CV、RC和GC之间分别存在2483、2967和4473个差异表达基因。这些差异表达基因的一部分参与了色素合成的信号通路,如黑色素生成通路中的基因(Mitfa、Pax3a、Foxd3、Mclr、Asip),酪氨酸代谢基因(Tyr、Dct、Tyrp1、Silva、Tat、Hpda)和Pteridine代谢基因(Gch1、Xdh、Ptps、Tc)等。转录组学分析和qPCR检测结果均表明,Mitfa与Tyr、Tyrp1、Dct、Tfe3a和Baxa等重要色素发育基因与红鲫“青转红”体色变迁密切相关;Mitfa扣可能作为主控基因通过调控黑色素合成或黑素细胞发育有关的基因表达在红鲫体色形成中起着重要作用。3.通过高通量技术研究了成体红鲫与白鲫皮肤组织基因表达信息,组装后分别得到了 56,564和56,612条Unigenes,红鲫与白鲫存在7117个差异表达基因,其中3434个基因在红鲫中高表达,3683个基因在白鲫中高表达,通过qPCR验证发现,黑色素合成相关基因如Tyr、Dct、Tyrp1和Mc1r在红鲫皮肤中低表达,而其他色素合成相关基因如Foxd3、Hpda、Ptps、Gchl和Sox9b则在红鲫皮肤中高表达。通过KEGG富集分析发现,在黑色素合成信号通路、糖异生和酪氨酸代谢等信号通路中存在大量差异表达基因的富集。4.通过MethylRAD甲基化测序技术研究了成体红鲫与白鲫皮肤中DNA甲基化位点信息,在红鲫与白鲫皮肤中分别得到了 17,147,966和16,568,891个甲基化标签,比对率分别为21.45%和18.08%。在红鲫与白鲫中分别得到了 96,122和88,536个CCGG甲基化位点,其平均深度分别为30.71和28.35;分别得到了 7,961和9,534个CCWGG甲基化位点,其平均深度分别为9.18和9.02。发现在色素发育相关基因如Tyr、Dct、Foxd3、Mitfa和Hpda等基因中均存在差异甲基化位点。通过KEGG富集分析发现在MAPK信号通路、cAMP信号通路、黑色素合成和Hippo等信号通路中存在大量差异甲基化基因,这些结果表明DNA甲基化在鲫鱼体色形成过程中起着重要作用。5.通过CRISPR/Cas9基因敲除与过表达载体技术,在红斑马鱼敲除了黑色素细胞调控基因Mitfa,发现Mitfa基因突变会导致红斑马鱼早期皮肤黑色素细胞缺失,过表达Mitfa发现其在早期能够增加黑色素细胞的表达,但不能拯救黑色素细胞最终的消退。综上所述,本研究利用高通量RNA-Seq技术在红鲫不同体色发育时期,获得了大量的差异表达基因和SNP位点信息,分析结果表明了在红鲫体色发育中Mitfa为主控基因调控Tyr和Dct等基因的表达,通过黑色素合成代谢途径调控着红鲫“青转红”的体色转变。Mitfa基因敲除与过表达分析进一步证实了Mitfa基因对鱼类黑色素细胞发育的重要调控功能。利用RNA-Seq和MethylRAD技术比较分析了成体红鲫与白鲫皮肤组织中差异表达基因与DNA甲基化位点信息,证实了黑色素合成关键酶Tyr基因的甲基化水平与体色密切关联。本研究中所获得的大量转录组学数据和DNA甲基化位点信息,为进一步揭示鱼类体色发育调控机制提供了分子遗传学依据。
【学位单位】：湖南师范大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

?素细胞。在４８ｈｐｆ时，眼色素出现，之后黑色素细胞在头部，背部和腹部相继增??加（图２－１，Ａ）；在５６ｈｐｆ时黑色素逐渐分布在红鲫全身（图２－１，Ｂ）；在７０ｈｐｆ时??在头部和背部可以观察到一些黄色素细胞，７２ｈｐｆ左右卵膜破裂，此时红鲫出膜??（图２－１，Ｃ）。在红鲫出膜后３ｄ左右可以观察有鱼鳔出现，在７ｄｐｈ左右在腹部出??现一些虹彩细胞（图２－１，Ｄ），同时在尾部也观察到有黄色素细胞、红色素细胞和??黑色素细胞（图２－１，Ｆ）。在适宜的温度和ＰＨ环境下，红舞有一部分幼鱼在６０ｄｐｈ??左右，黑色素细胞开始从背部脱落，呈现出淡黄色的表型（图２－１，Ｇ，Ｈ）。最后??在９０ｄ左右大部分红鲫黑色素细胞褪去呈现出橙色体色，最后逐渐变成红色体色??（图?２－１，Ｉ）。??ＡＢＣ??ｉｔｓ．??＿?—??ｊｆｆ??－??Ｇ?Ｈ?Ｉ??ｒ?ｔ??图２－１红鲫不同体色发育时期体色观察．Ａ：４８ｈｐｆ（４ｘ）；?Ｂ：４８ｈｐｆ（ｌ〇ｘ）；?Ｃ：?０ｄｐｈ（２０ｘ）；??Ｄ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｅ：７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｆ：?７ｄｐｈ（２〇ｘ）；?Ｇ：变色前（４０ｄ）；?Ｈ：变色中（６０ｄ）；?Ｉ：变色后（９０ｄ）。??其中Ｍ代表黑色素细胞

?织中色素细胞的形态和结构。其中在青灰色（ＧＣ）时期（ａ）、体色改变（ＣＶ）时期（ｂ）??和变色后红色（ＲＣ）时期（ｃ）的幼鱼（图２－２，?ａ，ｂ，ｃ）。在红鲫４０ｄｐｈ时，背部皮肤??组织中黑色素细胞和黄色素细胞同时存在，且黑色素细胞既有黑色素活跃的分枝??状又有黑色素细胞凝集态的圆形态；此时黄色素细胞也存在着分枝态和圆形态，??但大多分布在头背部（图２－２，?ｄ）；通过透射电镜观察黑色素细胞大多呈现圆形小??点而黄色素细胞也能看到但呈现弥散状（图２－２，?ｅ）。在红鲫６０ｄｐｈ时，黑色素细??胞数量出现了减少的趋势，且黄色素细胞有增加的趋势，黑色素细胞分枝态减少，??凝集态增加最后缩小直至消失（图２－２，?ｈ）。其中观察到含有黑色素细胞（黑箭头）、??黄色素细胞和红色素细胞，但在ＲＣ皮肤中没有黑素细胞。通过透射电镜观察黑??色素细胞明显减少

图３－１红鯽皮肤转录组拼接Ｕｎｉｇｅｎｅｓ长度分布概率统计图??Ｆｉｇｕｒｅ?３－１?Ｔｈｅ?ｐｒｏｂａｂｉｌｉｔｙ?ｇｒａｐｈ?ｏｆ?ｕｎｉｇｅｎｅｓ?ｌｅｎｇｔｈ?ｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎ?ｉｎ?ｔｈｅ?ｓｋｉｎ?ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｏｍｅ?ｏｆ??ｒｅｄ?ｃｒｕｃｉａｎ?ｃａｒｐ??３．３．２红鲫转录组组装数据的功能注释结果??
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本文编号：2856313