嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡水温对异育银鲫免疫应答的影响研究

发布时间：2020-10-26 17:11

　　 嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水产养殖中一种较常见的条件致病菌,给我国淡水养殖业造成了严重的经济损失。随着鱼类养殖业的快速增长,盲目投放抗生素的现象已经屡见不鲜。研究表明化学抗生素会导致细菌耐药性增加,同时抗生素会在鱼体内残留从而对水产品安全造成隐患,使用疫苗对鱼病进行免疫防控是今后的发展趋势。但是疫苗的免疫效果受免疫方式和环境因素的影响较大,本文以异育银鲫(Carassius auratus gibelio)为研究对象,控制其浸泡免疫嗜水气单胞菌灭活疫苗的水温,运用免疫毒理学、生物化学和分子生物学等相关技术,初步探讨了浸泡温度对异育银鲫免疫应答的影响。本研究将制备好的嗜水气单胞菌灭活疫苗稀释至1×10~8 CFU/mL,将异育银鲫分别在20℃、25℃和30℃的疫苗中浸泡免疫30min,然后捞出正常饲养。免疫后的3h、12h、48h和96h取样,用酶活测定试剂盒检测黏液和血清中溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)、碱性磷酸酶(AKP)和酸性磷酸酶(ACP)的活力。采用实时荧光定量PCR技术分析免疫应答相关基因表达情况:包括主要组织相容性复合体I(MHC I)、Toll样受体3(TLR3)和白介素11(IL-11)在鳃、后肠和脾中的表达情况。在免疫后的5d、7d、11d、18d和25d刮取黏液和分离血清,利用间接酶联免疫吸附实验(ELISA),对免疫后黏液和血清中特异性抗体的效价进行分析。免疫后的第25天,用浓度为3.74×10~6 CFU/mL(2×LD_(50))的菌液进行攻毒实验,计算相对免疫保护率(RPS)。主要结果如下:浸泡免疫后,血清和黏液中非特异性酶的活力都显著升高。(1)在黏液中,LZM的活力在浸泡免疫后短时期内随着浸泡温度的升高,上升趋势更加显著,酶活力达到峰值的时间更短,但随着时间的延长酶活力逐渐降低,最终趋于稳定。SOD、AKP和ACP的活力呈现出先上升后降低的趋势,在12h和48h之间酶活力达到峰值,同样随着浸泡温度的升高酶活力达到峰值的时间更短。(2)血清中,LZM的活力在各个温度浸泡组中无显著差异,直到96h各组酶的活力才显著增加。SOD的活力在30℃处理组达到峰值的时间更短,另外两组在12h左右达到峰值,随后出现稳定降低的趋势。AKP和ACP的活力在浸泡免疫后3h急剧上升,随后又恢复至正常水平,随着时间的延长酶活力呈现逐渐上升的趋势。浸泡免疫后三个基因在不同组织中表达量呈现不同程度的上升。在后肠中的表达量要显著高于另外两个组织,且受浸泡温度的影响较大,在25℃和30℃浸泡组基因的表达要显著高于20℃浸泡组。而在鳃和脾中基因表达的趋势相近,受浸泡温度的影响也不太显著。MHC I基因的表达在浸泡免疫后12h内显著上调,随后出现基因先下调后上调的趋势。TLR3基因的表达量随着时间的延长先上调后下调,在鳃和后肠中峰值出现的时间要比脾中峰值出现的时间早。IL-11基因的表达量随着时间的延长逐渐下调,在鳃中12h后基因的表达显著低于对照组,而后肠和脾中基因表达显著高于对照组。在30℃浸泡免疫组中,特异性抗体上升的时间更早且抗体效价也更高。以3.74×10~6 CFU/mL的菌液攻毒后进行免疫保护效果评估,结果显示在20℃、25℃和30℃三个温度中浸泡免疫的相对免疫保护率分别为38.9%、33.3%和50%。本文主要根据异育银鲫在不同温度中浸泡免疫嗜水气单胞菌灭活疫苗后血清和黏液中非特异性酶活力及特异性抗体的变化,以及免疫相关基因的组织差异性表达,初步探讨了浸泡温度对异育银鲫免疫应答的影响,结果显示浸泡免疫后可以显著增强鱼体的免疫应答效应,且30℃浸泡下免疫效果更佳。
【学位单位】：西南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S948
【部分图文】：

西南大学硕士学位论文3.2 实验结果3.2.1 黏液中非特异性酶活力变化不同实验组中，异育银鲫黏液 LZM、SOD、AKP 和 ACP 的活力变化如图 3-1所示。浸泡免疫后，LZM 活力在 3h 内迅速上升，与对照组相比差异显著（P<0.05），并且随着浸泡温度（20℃、25℃和 30℃）的升高，LZM 的活力也显著升高（P<0.05）。但随着时间的延长活力逐渐降低，并于 48h 后趋于平稳，与 20℃和 25℃处理组相比，30℃处理组的活力降低趋势更明显，48h 后与对照组 LZM 活力差异不显著（P>0.05）A B

图 3-2 异育银鲫血清中 LZM（A）、SOD（B）、ACP（C）和 AKP（D）活力的变化Figure 3-2. The changes of activities of LZM (A), SOD (B), ACP (C) and AKP (D) in serum ofCarassius auratus gibelioC 表示对照组，不同字母表示同一时间点不同温度浸泡组间的差异性（P<0.05）（平均值±标准误）。C: control. Different letters denote significant differences at 0.05 levels among different temperature groups at the same time point(P<0.05). (Mean ±S.E)3.3 讨论目前主要通过检测非特异性酶活力的变化以及免疫相关基因的表达来评估疫苗的免疫效果。而影响疫苗免疫效果的因素有很多，主要包括改变疫苗浸泡的渗透压、添加佐剂、调整最适浸泡浓度、浸泡时间以及最佳饲养水温等，但是关于最佳浸泡温度的研究却比较少见。本章主要通过非特异性酶活性的变化，探究浸泡温度对免疫应答的影响，因为非特异性酶除了在免疫防御中发挥重要作用以外，也对免疫效应具有指示作用。LZM 广泛存在于鱼类的体液、血清、巨噬细胞以及各种组织中，在鱼类免疫防御中发挥重要作用，包括溶解细菌、调理作用及增强免疫反应等，同时也是非

西南大学硕士学位论文分析1.6结果特异性抗体水平的变化鲫经过嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡后，黏液中特异性抗体水1 所示。总体而言，各个温度浸泡组之间趋势相同，随着时间平显著增加，18d 达到峰值，之后恢复到对照组水平。但是各在差异，免疫后第 7d，30℃浸泡组特异性抗体水平开），而另外两个温度浸泡组与对照组相比无显著性差异（P>0液中特异性抗体水平随着浸泡温度的升高而显著增加（P<0后在 25d 时恢复到正常水平。
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