南京地区气单胞菌的分离鉴定及嗜水气单胞菌菌株分型研究

发布时间：2020-10-27 14:11

　　 气单胞菌(Aeromonas)在水生生态系统中无处不在,存在于新鲜的河口水、地表水、污水、健康或患病鱼、食品、动物和人类粪便中,能够引起人和鱼类的感染。气单胞菌属是众所周知的鱼类条件致病菌,在应激条件下,如水温增加、水质不佳等,是疫情爆发的主要原因。为了确定南京市某渔场发病鱼感染的病原,本试验采集患鱼脏器,采用平板培养、生化实验和种特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株毒力基因的分布,分析其生物学特性,并进一步通过动物试验确定菌株致病力。结果分离到1株水族箱气单胞菌,命名为LK13-25。该菌株携带5种主要毒力基因:气溶素(aer)、细胞毒性肠毒素(aact)、细胞兴奋性肠毒素(alt)、温敏胞外蛋白酶(epr)和丝氨酸蛋白酶(ahP),溶血性和溶蛋白能力较强,对斑马鱼的半数致死量为1.02×103CFU/尾,确定为强毒株。进化树分析表明,水族箱气单胞菌与嗜水气单胞菌达卡亚种亲缘关系较近。本研究在国内首次报道发现水族箱气单胞菌,为进一步预防该菌所引起的相关疾病的发生和传播提供理论基础。为调查南京地区渔场的气单胞菌感染情况,于2013年10月至2014年10月,从发病、健康水生动物及水体环境中采集163份样品,采用平板培养和特异性gyrB基因扩增测序等方法进行细菌的分离鉴定;利用PCR技术检测分离株6种主要毒力基因act、alt、epr、ahp、ascV的分布;通过动物试验确定部分菌株致病力。结果显示,共鉴定出气单胞菌菌株147株,主要菌种为维氏气单胞菌(A.veronii)和嗜水气单胞菌(A.hydrophila),检出率分别为46.3%和34.7%;毒力基因中,除ascV之外,检出率都在50%以上,最高为94.6%,最低为68.0%;以斑马鱼为模型,对不同种的气单胞菌进行LD50的测定,结果显示嗜水气单胞菌的LD50明显高于其他种。以上结果可以看出,气单胞菌在南京地区渔场环境中广泛分布,并且含有多种毒力基因,具有潜在的公共危害,尤其以嗜水气单胞菌需要更多的关注。为了解嗜水气单胞菌分离株的O抗原情况,对所有已知嗜水气单胞菌O抗原基因簇进行分析,筛选出共同存在的单糖合成基因rmlA、rmlC和rmlD,对嗜水气单胞菌新分离株及实验室原保存菌株共71株进行分型,最后用MLST方法对部分菌株进行分类比较。结果显示,71株嗜水气单胞菌中共能检出57株与已知相一致的O抗原基因簇型,其中与中国流行菌株NJ-35和美国流行菌株ML09-119 O抗原基因簇相一致的菌株所占比重比较大,分别为56.14%(32/57)和33.33%(19/57)。比对MLST分析结果,除CS-43、JH-17株之外,NJ-35和ML09-119O抗原基因簇型的菌株都属于ST251和ST328,而两个型的菌株在斑马鱼致病性试验中都为强毒株,说明嗜水气单胞菌O抗原单糖合成相关基因与菌株的致病力有一定的相关性。研究结果显示,江苏地区的嗜水气单胞菌的流行株的O抗原基因簇型为NJ-35型和ML09-119型,O抗原基因簇相关基因分型方法可以作为一种新的分子分型方法应用于嗜水气单胞菌的流行病学调查中。综上所述,本研究对南京地区的气单胞菌感染情况进行了调查,并在国内首次分离到水族箱气单胞菌,同时对71株嗜水气单胞菌进行O抗原基因分型,研究结果为开展气单胞菌感染的流行病学调查和防控奠定了基础。
【学位单位】：南京农业大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2015
【中图分类】：S941.4
【部分图文】：

?２．２细菌的分子鉴定??分离菌株的ＰＣＲ扩増结果中，条带大小跟预期目的大小一致（图２－１）。巧ｒ公基??因序列比对结果表明，与目的基因序列同源性最高的菌株为水族箱气单胞苗ＭＤＣ?４７，??为?９９〇／〇。??ｌＯＯＯｂｐ＾＾＾Ｈ＾Ｈ?ｌｌＯＯｂｐ??７５。桶??图２－１?ｇ）７■公基因的ＰＣＲ检测??Ｍ：?２０００ＤＮＡ分子质量标准；１：菌株ＬＫ１３－２５；?２：菌株ＮＪ－３５；?３：阴性对照。??Ｆｉｇ．２－１?ＰＣ民?ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆｇｙｒ公??Ｍ；?Ｍａｒｋｅｒ?ＤＬ２０００；?ｌ：ＬＫ－２５；?２；?ＮＪ－３５；?３：?ｎｅｇａｔｉｖｅ?ｃｏｎｔｒｏｌ．??进化树分析表明，水族箱气单胞菌ＬＫ１３－２５与嗜水气单胞菌达卡亚种??（乂／ｙ碱＊０／７／２／／ａｓｓｐ？抓施亲缘关系较近，最大相似度９６％?（图２－２）。??３１??

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【参考文献】

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本文编号：2858627