中华鲟Ⅰ型干扰素IFNe2的生物学功能研究
发布时间：2020-10-30 03:01
Ⅰ型干扰素(IFN)是由病原感染细胞后分泌的多肽,具有抗病毒、抗细菌和抗肿瘤的活性,同时还能促进免疫应答调节。因此,了解发病中华鲟(Acipenser sinensis)中高表达的IFNes的功能有利于加强中华鲟的保护,并且有助于加深对免疫进化机理的认识。在本研究中我们通过体外重组中华鲟IFNe2蛋白,并对其功能进行了初步的研究。本试验将去除信号肽的中华鲟IFNe2编码区序列克隆进入pET-32a原核表达载体,发现中华鲟IFNe2在大肠杆菌中主要以可溶性蛋白的形式表达,通过镍亲和层析可以得到较纯的重组IFNe2蛋白。为了后续更好地对IFNe2的功能进行研究,我们将位于中华鲟干扰素调节因子(IRF)3及IRF7 DBD(DNA-binding domain)结构域与IAD(IRF association domain)结构域之间的序列克隆到pET-32a载体中,发现IRF3和IRF7也都能以可溶性蛋白的形式表达,并且可以得到较纯的蛋白用于多克隆抗体制备。在4次免疫小鼠之后,获得了较高效价的IRF3和IRF7多克隆抗体,其中IRF3抗体滴度超过1:729000,IRF7抗体滴度超过1:81000,此外,通过Western Blot检测IRF3和IRF7多克隆抗体的特异性发现两个多克隆抗体都具备较强的特异性。在中华鲟中,过去的报道已经研究了IFNe2时空表达规律,但其生物学功能尚不清晰。本试验检测了IFNe2的抗病毒作用,并且研究了IFNe2对IFN信号通路的影响。结果显示,添加终浓度为1μg/mL重组中华鲟IFNe2蛋白能够诱导EPC(epithelioma papulosum cyprini)细胞中Mx、PKR和Viperin的表达而激活EPC细胞的抗病毒活性,并且可以降低EPC细胞中SVCV(spring viraemia of carp virus)病毒G蛋白、N蛋白和P蛋白的表达,减少病变效应的产生,这一结果说明中华鲟IFNe2具备抗病毒活性。重组中华鲟IFNe2蛋白还能影响IFN信号通路上基因的表达。通过在中华鲟鳍细胞系中加入1μg/mL的重组IFNe2蛋白可以诱导Mx、PKR、Viperin和ADAR4等干扰素刺激基因的表达,尤其是极显著地上调了Mx和Viperin的表达,但是重组IFNe2不能诱导ADAR1-1和ADAR1-2的表达,此外,重组IFNe2可以诱导IRFs的表达,在诱导后3 h和6 h时显著上调IRF1和IRF2的表达,并持续上调IRF3和IRF7的表达至24 h,且诱导IRF7发生磷酸化。在加入1μg/mL的重组IFNe2蛋白刺激中华鲟鳍细胞系后,细胞中IFNe1和IFNe3的表达都在3 h时出现显著上调,并且随后就恢复到正常水平,同时IFNe2还能诱导其自身的表达,在6 h时先出现下调,随后在12 h时出现极其显著的上调表达。这些结果说明IFNe2可能通过诱导IRF7发生磷酸化而扩大IFN的免疫应答。IRF是病毒和细菌诱导IFN信号通路的转录介质,在多种细胞过程中起着重要作用,例如抵抗病毒入侵,促进细胞生长和凋亡等。IRF对IFN的转录起着至关重要的作用,为了了解中华鲟IRF对IFNe2转录的调控,本文以长江鲟(Acipenser dabryanus)为研究对象研究了IRF1、IRF3、IRF4、IRF5和IRF8的结构及表达模式。除了IRF1外,所有IRF由8个外显子和7个内含子组成。此外,在预测的蛋白质序列中,DBD结构域与斑点雀鳝(Lepisosteus oculatus)具有最高的一致性。关于表达模式,发现五种IRF基因在所有检测的组织中组成型表达,并且在血液,肾,肠和脾中具有更高的表达。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后,IRF1和IRF3的表达在脾脏和中肾中上调,而IRF5和IRF8基因在中肾中均下调。此外,感染3 h后IRF4在脾和中肾中被嗜水气单胞菌显着上调。这些结果表明长江鲟IRF1、IRF3和IRF4可能对依赖于细菌诱导的IFN的转录起着重要的作用。
【学位单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
图 1-1 鱼类 I 型 IFN 诱导途径的假设模型[38]Fig 1-1 Hypothetical model of fish type I IFN induction pathway含 175-185 个氨基酸残基，其中前 22-23 个氨基酸为信号肽，不同鱼类的 I 型干扰素的信号肽肽段之间相似性很高[5]。通过进化树、氨基酸序列比对以及保守的半胱氨酸（C）模式等分析，硬骨鱼类 I 型干扰素又被分为 group I（包括 IFN-a, -e, -d,-h）和 group II（包括 IFN-b, -c, -f）两类[23-27]。IFNa，IFNd 在绝大多数研究的硬骨鱼类中均已发现[28, 29]。IFNh 在鲈形目的大黄鱼（Larimichthys crocea）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）、大西洋白姑鱼（Argyrosomus regius）中均有报道[24-26]。IFNe研究报道最少，仅在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）以及中华鲟（Acipenser sinensis）中进行了初步的研究[4,23,27,30]。作为group II的IFNb，IFNc 已经在鲤形目[31]、鲑形目[32]、鲇形目[33, 34]、鲈形目[24-26, 35]、鳗鲡目[27]等鱼类中陆续被报道；此外，IFNf 也被发现于鲑形目[4]。1.2.2 I 型干扰素的进化与分化从进化的角度看，I 型干扰素存在于多种脊椎动物中，包括鱼类[36-38]，两栖类[22]，
第 1 章 绪论类同时具有两个半胱氨酸（C1 和 C3）和四个半胱氨酸（C1、C2、C3 和 C4）的 I 型干扰素，而高等脊椎动物 I 型干扰素均含有四个半胱氨酸（哺乳类 IFN-β、-ε除外）[5]。因此，他们提出一个假说：鱼类拥有最多外显子的 I 型干扰素，而在两栖类开始出现无内含子的 I 型干扰素；在爬行类和鸟类或哺乳类出现的过程中，由于基因组逆转座作用导致羊膜动物 I 型干扰素丢失了内含子；两栖类无内含子的 I 型 IFN 是现代羊膜动物无内含子的 I 型 IFN 的祖先，非洲爪蟾无内含子的 I 型IFN 可能仅仅代表爪蟾中或者两栖类中的一个独立的分叉，羊膜动物无内含子的 I型 IFN 可能发生在爬行动物从两栖类进化过程中的逆转座现象[5, 22, 28]。
第 1 章 绪论发现了 IFN1 的两个剪切异构体，这两个 IFN1 异构体缺乏信号肽，称为细胞内的IFN（iIFN1），同时也发现了两个缺乏信号肽的 IFNR 异构体（iIFNR1 和 iIFNR2）。当 iIFN1 与 iIFNR1 和 iIFNR2 结合时，能诱导 STAT1 和 STAT2 发生磷酸化，并且最终诱导干扰素刺激基因的产生[72]。
【相似文献】
本文编号：2861882
【学位单位】：长江大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
图 1-1 鱼类 I 型 IFN 诱导途径的假设模型[38]Fig 1-1 Hypothetical model of fish type I IFN induction pathway含 175-185 个氨基酸残基，其中前 22-23 个氨基酸为信号肽，不同鱼类的 I 型干扰素的信号肽肽段之间相似性很高[5]。通过进化树、氨基酸序列比对以及保守的半胱氨酸（C）模式等分析，硬骨鱼类 I 型干扰素又被分为 group I（包括 IFN-a, -e, -d,-h）和 group II（包括 IFN-b, -c, -f）两类[23-27]。IFNa，IFNd 在绝大多数研究的硬骨鱼类中均已发现[28, 29]。IFNh 在鲈形目的大黄鱼（Larimichthys crocea）、鳜鱼（Siniperca chuatsi）、大西洋白姑鱼（Argyrosomus regius）中均有报道[24-26]。IFNe研究报道最少，仅在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、日本鳗鲡（Anguilla japonica）以及中华鲟（Acipenser sinensis）中进行了初步的研究[4,23,27,30]。作为group II的IFNb，IFNc 已经在鲤形目[31]、鲑形目[32]、鲇形目[33, 34]、鲈形目[24-26, 35]、鳗鲡目[27]等鱼类中陆续被报道；此外，IFNf 也被发现于鲑形目[4]。1.2.2 I 型干扰素的进化与分化从进化的角度看，I 型干扰素存在于多种脊椎动物中，包括鱼类[36-38]，两栖类[22]，
第 1 章 绪论类同时具有两个半胱氨酸（C1 和 C3）和四个半胱氨酸（C1、C2、C3 和 C4）的 I 型干扰素，而高等脊椎动物 I 型干扰素均含有四个半胱氨酸（哺乳类 IFN-β、-ε除外）[5]。因此，他们提出一个假说：鱼类拥有最多外显子的 I 型干扰素，而在两栖类开始出现无内含子的 I 型干扰素；在爬行类和鸟类或哺乳类出现的过程中，由于基因组逆转座作用导致羊膜动物 I 型干扰素丢失了内含子；两栖类无内含子的 I 型 IFN 是现代羊膜动物无内含子的 I 型 IFN 的祖先，非洲爪蟾无内含子的 I 型IFN 可能仅仅代表爪蟾中或者两栖类中的一个独立的分叉，羊膜动物无内含子的 I型 IFN 可能发生在爬行动物从两栖类进化过程中的逆转座现象[5, 22, 28]。
第 1 章 绪论发现了 IFN1 的两个剪切异构体，这两个 IFN1 异构体缺乏信号肽，称为细胞内的IFN（iIFN1），同时也发现了两个缺乏信号肽的 IFNR 异构体（iIFNR1 和 iIFNR2）。当 iIFN1 与 iIFNR1 和 iIFNR2 结合时，能诱导 STAT1 和 STAT2 发生磷酸化，并且最终诱导干扰素刺激基因的产生[72]。
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1 李由申;中华鲟Ⅰ型干扰素IFNe2的生物学功能研究[D];长江大学;2019年
本文编号：2861882
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