红螯螯虾抗脂多糖因子的分子特性及其免疫功能研究

发布时间：2020-11-01 17:13

　　 对虾白斑综合症病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的宿主范围广泛,能感染绝大多数的虾蟹类,是虾蟹类水产养殖业的主要病原,传染力强,致死率高,给全球水产养殖业造成了巨大的经济损失。由于对WSSV的致病机理知之甚少,至今为止仍未找到一个行之有效的方法根治WSSV。在课题组的前期研究中,从WSSV感染的红螯螯虾(Cherax quadricarinatus)造血组织(Haematopoietic tissue,Hpt)细胞差异基因表达谱中筛选到了两种抗脂多糖因子(Anti-lipopolysacride Factor,ALF),一种为诱导上调表达的 CqALF,另一种为表达量无显著变化的CqALF2。本论文利用红螯螯虾Hpt细胞体外培养系统、荧光定量PCR、电镜观察和重组蛋白真核表达等技术初步探究了CqAL 的抗病毒机理。取得成果如下:(1)克隆获得了红螯螯虾CqALF基因cDNA全长序列(GenBank登录号:KX083340)和CqALF 的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF)序列。CqALF基因cDNA全长序列包括ORF 372 bp,5'非编码区108 bp,3'非编码区383 bp。其ORF编码123个氨基酸,预测蛋白分子量大小为13.35 kDa。CqALF2的ORF为372 bp,编码123个氨基酸,预测蛋白大小约为13.86 kDa。螯虾两种ALF均具有两个半胱氨酸连接的保守的LPS结合位点(LPS Binding Domain,LBD),预测的信号肽位置为前25个氨基酸。(2)阐明了 CqALF基因在健康螯虾各组织器官的分布情况,结果显示CqALF分布于检测的所有组织器官中,在胃、上皮和眼柄中表达量最高。(3)为鉴定CqALF的生物学活性,优化真核表达和纯化工艺获得CqALF重组蛋白 rCqALF。利用最小抑菌浓度(Minimum Inhibitory Concentration,MIC)和最小杀菌浓度(Minimum Bactericidal Concentration,MBC)法检测 rCqALF对所测试20种菌的抗菌活性。rCqALF对荧光假单胞菌等四种革兰氏阴性菌和金黄色葡萄球菌等四种革兰氏阳性菌具有明显的抑杀活性,其中对弗氏志贺氏菌和金黄色葡萄球菌的杀菌活性较高,弗氏志贺氏菌的MBC小于6μM,而金黄色葡萄球菌则小于12μM。(4)rCqALF可以与WSSV囊膜蛋白互作,破坏病毒囊膜结构,继而降低WSSV对宿主的感染率。电镜观察下rCqALF显著破坏病毒囊膜结构,荧光定量检测结果显示rCqALF使得WSSV对体外Hpt细胞的感染率显著下调,并且rCqALF提高了螯虾活体抵御WSSV感染的保护力。本研究揭示了CqALF在螯虾免疫系统中发挥关键作用,不仅具有广谱抗菌活性,并且可以直接破坏WSSV囊膜蛋白达到抗病毒效果,为甲壳动物抗WSSV新药的研发提供了新的思路。
【学位单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S945.4
【部分图文】：

ＷＳＳＶ是一类具囊膜，无包涵体包被，有尾巴的杆状双链ＤＮＡ病毒。在电??镜观察下，横切面为圆形，纵切面呈椭圆形，长度约３００?ｎｍ，宽度约１００?ｎｍ。??其形态结构如图１－２所示。完整的病毒粒子由三部分构成，从外到里分别是病毒??囊膜（Ｅｎｖｅｌｏｐｅ）、被膜层（Ｔｅｇｕｍｅｎｔ）和核衣壳（Ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄ）。??Ｗｆ?％?Ｈ｜?＾■纖＝一ｎｓ：??■?■國一—揭＝，ＶＰ５１Ｃ，??ＶＰ９５？ＶＰ３９Ａ＊??ｖｐ２６，?？?：?￥?—Ｅｎｖｅｌｏｐｅ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ：??漏＿?奶，??ａ?ｂｅ??图１－１?ＷＳＳＶ的形态结构ｆ２１??Ｆｉｇ．?１－１?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ＷＳＳＶ??ａ：完整的病毒例子；ｂ：核衣壳结构；ｃ：病毒粒子三部分的结构示意图。??１??

导吞噬、包囊作用和形成结节等产生一系列免疫应答反应。体液免疫则是通过合??成抗菌肽、激活酚氧化酶系统和产生凝集素等体液相关免疫效应分子发挥防御功??能［１８］（见图１－２）。对于甲壳动物而言，细胞免疫和体液免疫均是免疫系统必不??可少的，两者相辅相成，因为参与体液免疫的免疫效应分子必须从血细胞中合成??并释放出来发挥功能。??ｆ?＾?：?．ｉＸｙ?＇－?．?，ｕ?ｎ?，?，Ｉ—ＸＵｆ?５」關＿？１？１＿１１＿＊＊＿？！＊．＿??ＰＨＡＧＯＣＹＴＯＳＩＳ?ＮＯＤＵＬＥ?ＥＮＣＡＰＳＵＬＡＴＩＯＮ??ｙ?夢、ｙ?（?ＦＯＲＭＡＴＩＯＮ?；??零職??Ｄｉｓｅａｓｅ－??ｃａｕｓｉｎｇ?ａｇｅｎｔｓ?乂?ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｂｙ?Ｔｏｉｌ??ｈｒｐａｒｈ?ｒｅｃｅｐｔｏｒｓ，?ｐａｔｔｅｒｎ??ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ?ｐｒｏｔｅｉｎｓ?ｅｔｃ．??ｉｎｔｅｇｕｍｅｎｔ??Ａｔ?ＪＬ??Ｗ??Ｈｕｍｏｒａｌ?Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ?Ｐｒｏ－?Ｌｅｃｔｉｎｓ?ａｎｄ??ｐｅｐｔｉｄｅ?（ＡＭＰ）?ｐｈｅｎｏｌｏｘｉｄａｓｅ?ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ－??ｅｖｅｎｔｓ?ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ?ｃａｓｃａｄｅ?ｌｉｋｅ?ｆａｃｔｏｒｓ??图１－２无脊椎动物的先天免疫系统１１８１??Ｆｉｇ?１－２?Ｔｈｅ?ｉｎｎａｔｅ?ｉｍｍｕｎｅ?ｓｙｓｔｅｍ?ｏｆ?ｉｎｖｅｒｔｅｂｒａｔｅｓ??１．２．２细胞免疫??甲壳动物的血细胞主要有三类，透明细胞（细胞内没有或者极少微小颗粒，??属于嗜碱性细胞），半颗粒细胞（细胞内有小颗粒，既嗜酸性或嗜碱性）和颗粒??细胞（细胞内有大型颗粒

运用ＲＡＣＥ技术扩增Ｃ＃ｉＦ的５’和３’端序列，应用ＤＮＡｍａｎ软件拼接??得到?Ｃ如ＺＦ?基因?ｃＤＮＡ?全长（ＧｅｎＢａｎｋ?登录号?ＫＸ０８３３４０）。的?ｃＤＮＡ??全长序列和氨基酸序列如图２－２所示，ＣｇＡＬＦ的ｃＤＮＡ全长８６３ｂｐ，通过ＥｘＰＡＳｙ??在线网站分析其ＯＲＦ框为３７２?ｂｐ，预测尸的蛋白长度为１２３个氨基酸，分??子量大约为１３．３５?１＾＆，等电点则为９．５〖。非翻译区５’１；丁１１有１〇８＆０，３’１；丁尺则??有３８３?ｂｐ并具有典型的Ｐｏｌｙ?（Ａ）尾巴。Ｃ＋４ｉ：Ｆ２和有着相同的ＯＲＦ序??列长度（图２－３），分子量为１３．８６ｋＤａ，等电点为９．１２。??１９??
【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 陈冰;黄燕华;曹俊明;赵红霞;陈晓瑛;王国霞;孙育平;;家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾抗白斑综合征病毒能力的影响[J];广东农业科学;2015年12期

2 石广举;孙力军;王雅玲;刘唤明;徐德峰;聂芳红;刘颖;叶日英;;纳豆芽孢杆菌NT-6抗菌脂肽对凡纳滨对虾生长性能及非特异性免疫指标的影响[J];广东农业科学;2014年22期

3 欧阳冰;黄永彤;黄自然;陈志斌;;抗菌肽新型预混合剂饲养南美白对虾的效果试验[J];广东饲料;2013年08期

4 林鑫;毛述宏;杨阳;林仕梅;罗琳;;饲料中添加抗菌肽对锦鲤生长、非特异性免疫力和抗病力的影响[J];动物营养学报;2013年08期

5 王一娟;何义进;谢骏;刘波;戈贤平;周群兰;徐磊;潘良坤;陈汝丽;;抗菌肽对河蟹生长、免疫及抗氧化能力的影响[J];江苏农业科学;2011年02期

6 陈冰;曹俊明;陈平洁;赵红霞;蓝汉冰;朱选;;家蝇抗菌肽对凡纳滨对虾生长性能及免疫相关指标的影响[J];中国水产科学;2010年02期

7 曾祥兴;张驰;李康生;;无脊椎动物体液免疫研究进展[J];微生物学免疫学进展;2009年03期

8 温刘发;何丹林;张常明;翁照南;黄自然;毕英佐;;抗菌肽酵母制剂的生产及其作饲料添加剂应用价值的探讨[J];广东蚕业;2001年02期

9 徐海圣,徐步进;甲壳动物细胞及体液免疫机理的研究进展[J];大连水产学院学报;2001年01期

10 王建平,吴雄飞;虾类血细胞及体液免疫的研究现状[J];浙江海洋学院学报(自然科学版);2000年04期

相关硕士学位论文 前2条

1 邬君君;对虾白斑综合症病毒（WSSV）进入宿主细胞的方式及增殖情况[D];国家海洋局第三海洋研究所;2013年

2 郭慧芝;中华绒鳌蟹cDNA文库的构建及免疫相关基因的克隆与表达[D];华中农业大学;2010年

本文编号：2865842