一氧化氮在厚壳贻贝变态发育和免疫中的作用研究

发布时间：2020-11-04 19:35

　　 一氧化氮(Nitrc Oxide,NO)是一氧化氮合酶(Nitrc Oxide Synthase,NOS)在热激蛋白90(Heat Shock Protein 90,HSP90)的协同作用下,分解L-精氨酸产生的一种第二信使分子。以往研究中,NO是海洋无脊椎动物幼虫变态的一种负调节因子,同时也是免疫系统中重要的调节因子,其对厚壳贻贝变态和免疫中的影响尚未有报道。本文通过药理学、分子生物学和免疫刺激三种方法探究NO在厚壳贻贝幼虫变态发育和成体免疫中的作用。1.NO供体、NOS抑制剂对厚壳贻贝幼虫变态的影响为探究NO在厚壳贻贝幼虫变态中的作用,通过药理学实验探究了NOS抑制剂和NO供体在厚壳贻贝幼虫变态发育调控作用。结果显示,在24 h暴露和持续暴露实验中,NOS抑制剂aminoguanidine hemisulfate、S-methylisothiourea sulfate、L-NG-nitro arginine、7-nitroindazole均对厚壳贻贝幼虫变态表现出诱导作用,其中aminoguanidine hemisulfate的诱导活性最高,在持续暴露实验中,稚贝率达到49%;NO供体L-Arginine、S-Nitroso-N-acetyl-DL-penicillamine、sodium nitroprusside均对厚壳贻贝幼虫的变态有不同程度的抑制作用。综上,NO对厚壳贻贝幼虫的变态起到抑制作用,本研究成果为厚壳贻贝变态发育调控机制的研究提供有效理论依据。2.厚壳贻贝一氧化氮合酶基因的时空表达为进一步了解一氧化氮信号通路在厚壳贻贝变态中的分子机制,利用RACE技术获得了厚壳贻贝的NOS基因cDNA序列。其总长度为5091 bp,含有一个4497 bp的开放性阅读框,编码1497个氨基酸序列。根据转录组中的厚壳贻贝cDNA序列设计定量PCR引物,利用实时荧光定量PCR(Real-time quantitative PCR)技术测定了NOS基因在野生厚壳贻贝幼虫不同发育阶段(担轮幼虫、D形幼虫、壳顶幼虫、眼点幼虫、稚贝),以及厚壳贻贝成体组织(消化腺、性腺、足、闭壳肌、外套膜、鳃)中的表达水平,并利用NOS酶活力测定实验在蛋白水平验证在发育阶段中NOS基因的表达情况。在不同发育阶段中,NOS基因在壳顶幼虫阶段的表达量最高,眼点幼虫、稚贝时期表达量依次降低;NOS酶活力在担轮幼虫阶段酶活力最低,D形幼虫、壳顶幼虫阶段活力最高,眼点幼虫、稚贝阶段活力下降,与NOS基因在发育阶段的表达趋势相符。推测NOS在厚壳贻贝壳顶幼虫阶段参与了贝壳形态结构发生转变的过程以及某些器官的形成与发育,而其在眼点幼虫、稚贝两个变态的关键阶段,NOS基因的表达和NOS酶活力都较之前有下降,表明NO对厚壳贻贝幼虫的变态起到抑制作用,这与药理学实验结果相符。成体组织中,NOS基因在鳃部表达量最高,足、消化腺、雄性腺中次之,推测NOS基因在厚壳贻贝成体中参与了呼吸、滤食、消化等活动。HSP90基因在壳顶幼虫表达量最高,在眼点幼虫和稚贝中表达量依次降低。综上,NO对厚壳贻贝幼虫的变态起到抑制作用,本研究为进一步开展双壳贝类NO信号通路的功能研究提供了一定的理论依据。3.灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响为探究灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响,用1×10~6 cell/ml、1×10~7 cell/ml、1×10~8 cell/ml三个浓度的灿烂弧菌刺激厚壳贻贝,探讨弧菌刺激后厚壳贻贝的一氧化氮合酶(NOS)、一氧化氮(NO)、超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MAD)等免疫指标和淀粉酶、蛋白酶等消化酶的变化情况。结果显示,足、鳃、消化腺三个组织在弧菌刺激48 h后,只有消化腺的NOS活性较对照组有显著性升高,且酶活性随初始细菌浓度的升高而升高,故选用消化腺来测定灿烂弧菌刺激后72 h内的免疫指标和消化酶活性的变化。灿烂弧菌刺激后,48 h内NOS活性较对照组均显著升高。NO含量较对照组均显著升高,与NOS显现相同变化趋势。SOD活性在各浓度刺激下较对照组均显著升高,而MAD含量在实验组中含量显著低于对照组。淀粉酶活性在实验组中显著低于对照组,总体呈现先下降,后升高的趋势。蛋白酶活性在各实验组中均呈现先升高后下降的趋势。本研究表明灿烂弧菌能刺激厚壳贻贝免疫指标和蛋白酶活性的升高,但对蛋白酶的活性有抑制作用。本研究初步探明了厚壳贻贝对灿烂弧菌的免疫应答机制,为进一步研究灿烂弧菌和厚壳贻贝相互作用机制以及厚壳贻贝免疫机制奠定了基础。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
第一章 一氧化氮在海洋无脊椎动物附着和免疫中的作用
    1 一氧化氮对动物生长发育的影响的研究
        1.1 一氧化氮简介
        1.2 一氧化氮信号通路
        1.3 一氧化氮在各组织中的生理调节功能
    2 海洋无脊椎动物幼虫变态发育的分子机制
        2.1 多毛类幼虫附着变态发育的分子机制
        2.2 藤壶幼虫附着变态的分子机制
    3 一氧化氮基因对海洋无脊椎动物生长发育影响的研究
    4 NO在水生动物免疫中的研究
        4.1 NO在鱼类中的免疫
        4.2 NO在虾类中的免疫
        4.3 NO在软体动物中的免疫
    5 本研究展望
第二章 NOS抑制剂、NO供体对厚壳贻贝幼虫变态发育的影响
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 化学物质母液配制
        1.3 幼虫变态实验
        1.4 数据处理
    2 结果
        2.1 NOS抑制剂对厚壳贻贝幼虫变态的影响
        2.2 NO供体对厚壳贻贝幼虫变态的影响
    3 讨论
第三章 厚壳贻贝NOS基因的时空表达
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 总RNA的提取
        1.3 一氧化氮合酶基因克隆
        1.4 序列分析
        1.5 荧光定量RT-PCR
        1.6 蛋白定量
        1.7 NOS活性测定
        1.8 数据处理
    2 结果
        2.1 一氧化氮合酶基因全长cDNA序列特征和系统进化分析
        2.2 厚壳贻贝NOS基因、HSP90基因的表达分析
        2.3 一氧化氮合酶活力的测定
    3 讨论
第四章 灿烂弧菌对厚壳贻贝免疫指标和消化酶活性的影响
    1 材料和方法
        1.1 实验菌株
        1.2 实验材料
        1.3 总蛋白的提取
        1.4 免疫指标及消化酶活性的测定
        1.5 数据分析
    2 结果
        2.1 足、鳃、消化腺NOS酶活性比较
        2.2 免疫相关指标的变化
        2.3 消化酶的比较
    3 讨论
小结
参考文献
附录
致谢

【参考文献】

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本文编号：2870513