中华绒螯蟹褪黑素受体基因克隆及生殖细胞中的分布与功能

发布时间：2020-11-10 04:10

　　 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹,属于甲壳纲,是我国具有经济价值的养殖品种之一,广泛分布于淡水地区。1958年,从牛松果腺的提取物中发现了褪黑激素(Melatonin,MT),又叫褪黑素。MT主要由动物松果腺分泌的一种激素,被认为是调节哺乳动物季节性繁殖的主要影响因子。在进化过程中MT被保存下来,说明MT有其独特之处。MT在甲壳纲动物的血糖稳态以及促进蜕皮和附肢再生中发挥着重要的调节作用,甚至可以通过影响X器官-窦腺复合体中激素的释放,从而影响卵巢发育和成熟,而MT大多是通过褪黑素受体(Melatonin receptors,MTR)实现其功能的。但是MT与MTR是如何实现这些变化的许多分子机制需要进一步的明确。最近,有人发现在雄性河蟹性腺的发育的过程中MTR基因表达显著下调,说明MTR参与了河蟹性腺的发育,而MTR在雄性河蟹生殖细胞中的分布特征及在生殖方面的功能还不清楚。本论文通过制备其相应的抗体进行免疫定位,分析MTR在河蟹生殖细胞和顶体反应过程中的分布特征以及MT和MTR对精子顶体反应的影响和可能存在的作用机制,为进一步分析MT和MTR的作用及为顶体反应的分子机制提供理论依据。该实验首先对本实验室已有的河蟹精巢转录组数据库进行生物信息学分析,确定了制备多克隆抗体的免疫原序列,利用聚合酶链式反应得到的免疫原的基因序列。将带酶切位点的MTR的基因片段用Nde I和Xho I酶进行酶切,同样用这两种酶对载体pET-21b进行酶切,酶切后,利用连接酶将两者进行连接,获得含有MTR基因片段的重组质粒,通过转化进入到感受态细胞BL21(DE3)中,得到可以大量表达河蟹MTR蛋白的工程菌株。原核表达的MTR重组蛋白以包涵体形式存在,该包涵体是由尿素溶解的,并利用载体上的组氨酸与镍柱的亲和特性来纯化得到MTR免疫原蛋白,然后对小鼠进行免疫,根据间接ELISA法来检测MTR抗血清的效价。利用免疫印记实验验证获得的MTR多克隆抗体能够有效的与其抗原结合。应用免疫荧光技术,对河蟹的生殖细胞中的MTR进行定位分析。利用伊红染色观察精子,将提取的河蟹的新鲜精子分成4组,(1)对照组,用DMSO处理;(2)用MT处理;(3)用MT和MTR抗血清;(4)用MT和阴性血清处理,并统计计算精子的顶体反应率。实验结果显示:在精子发生过程中MTR一直存在,在河蟹的精原细胞和精母细胞中,MTR均匀的分布在其质膜上,在精细胞及中期精细胞中,MTR在质膜上的分布不均匀,但是在精子时期,MTR定位于精子的顶体管膜上,并且在顶体反应过程中,MTR一直存在;在统计精子顶体反应率中,DMSO组与MT处理组间、MT处理组与MT和MTR抗血清处理组间均有极显著性差异;DMSO组与加入10μM的MT和阴性血清两组间存在极显著性差异,而MT处理组与MT和阴性血清处理组间没有差异。这说明MTR对河蟹精子的顶体反应有作用,并且MTR可能是通过与MT结合促进精子的顶体反应。
【学位单位】：河北大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

最终形成N-乙酰基-5-甲氧基色胺，即褪黑素[3]（图1-1）。图1-1 褪黑素化学结构[3]Fig.1-1 Chemical structure of melatonin[3]1.1.2 褪黑素的作用MT在生物体内发挥着各种各样的生物效应，作为广谱抗氧化剂[4]，改善睡眠[5-7]，维持葡萄糖的稳态[8]，调控细胞增殖和凋亡及昼夜节律、视觉、脑血管、生殖、神经内分泌和神经免疫功能[9-11]。MT是一种比较著名的天然抗氧化剂，其抗氧化作用已经在各种病理条件下有了很广泛的研究，研究结果表明其作用主要与自由基有关[12-15]。研究证实了MT在抗氧化防御系统中，参与调控一些酶的活性，如谷胱甘肽过氧化物酶；或直接清除活性氧，如过氧基、一氧化氮等一些强氧化性的物质[15]

图 1-2 MTR 的信号通路[75]a)褪黑素受体 MT1 或 MT2 单体受体信号；MT1 和 MT2 偶联 Gαi、β 和 γ 蛋活性，使得 cAMP 水平下降。(b)MT1/MT2 异质二聚体受体信号；MT1/MT调控磷脂酶 C 和二酰基甘油通路，引起细胞内 Ca2+浓度上升。AC：腺苷酸环 C；DAG：二酰基甘油；IP3：肌醇三磷酸；PIP2：磷脂酰肌醇二磷酸；PLCFig. 1-2 The signal pathway of MTR[75]T1 or MT2 monomeric receptor signaling. Both MT1 and MT2 melatonin receptois toxin–sensitive Gαi, β, γ proteins, inhibiting adenylyl cyclase and reduceing the P. (b) MT1/MT2 heterodimer receptor signaling. MT1/MT2 melatonin receptorssis toxin-insensitive Gq, β, and γ proteins. Melatonin binding with MT1/2 receptorphospholipase C and DAG pathway and then up-regulates the concentration of Cnylyl cyclase; DAG: diacylglycerol; IP3: inositol triphosphate; PIP2: phospha- tidbisphosphate; PKC: protein kinase C; PLC: phospholipase C.黑素受体与生殖要通过与高亲和力受体结合级联下游信号通路发挥作用。哺乳动物膜上的分布是不均匀，且不同的物种间分布也是不同的，即使是那种马和驴，同一时期射精的精子中也定位于不同位置。MTR在不能可能是不同的，它的功能可能与受精过程有关，可能通过提高其

7图 1-3 中华绒螯蟹精子发生过程[85]a、a’、a’’：精原细胞；b、b’ 、b’’：初级精母细胞；c、c’、c’’：减数第一次分裂；c’’：次级精母细胞；d、d’：精细胞；d’’：精子；Sg：精原细胞；PSc：初级精母细胞；SSc：次级精母细胞；St：精细胞；Sz：精子（标尺 20 μm）Fig. 1-3 Spermatogenesis in E. sinensis.a, a', a": Spermatogonium; b, b', b": Primary spermatocytes; c, c':The occurrence of thefirst division of meiosis; c": Secondary spermatocyte; d, d': Spermatids; d": Spermatozoa.Sg: spermatogonium; PSc: primary spermatocytes; SSc: secondary spermatocyte; St: spermatids; Sz:spermatozoa (bar 20 μm）1.3.2 河蟹精子结构河蟹的精子会相互聚合形成一团，外被一些物质包裹着，这含有很多精子的小团就是精荚[86]。精子结构（图1-4）主要由细胞核、辐射臂和顶体三个部分构成。其细胞核因形状似“杯”而被称为核杯；河蟹精子上存在放射状突起，同时，它也是核杯外侧的突
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本文编号：2877456