褶纹冠蚌GST基因克隆与表达分析
发布时间：2020-11-10 21:07
褶纹冠蚌(Cristaria plicata)是我国重要的淡水育珠蚌之一,易受病原体感染而发生疾病,对育珠能力会产生较大的影响,因此,开展对贝类分子免疫的研究具有重要意义。本文采用了巢氏PCR方法和RACE PCR技术克隆得到了褶纹冠蚌的Sigma型谷胱甘肽S-转移酶(glutathione S-transferase,GST)基因的cDNA序列。CpGST1 cDNA序列全长为1610 bp,其中690 bp的开放阅读框编码230个氨基酸,5’端非编码区320 bp,3’端非编码区600 bp。预测编码的蛋白分子量为25.8 kD,等电点为8.87,由SignalP软件分析发现没有信号肽。克隆得到的CpGST2 cDNA长为826 bp,其中642 bp的开放阅读框编码213个氨基酸,5’端非编码区151 bp,3’端非编码区33 bp。预测编码的蛋白分子量为23.9kD,等电点为6.67,由SignalP软件分析发现没有信号肽。通过对CpGST1和CpGST2基因在褶纹冠蚌不同组织中的表达分析发现,在血淋巴、肝胰腺、闭壳肌、外套膜、鳃组织中均有表达,但表达存在一定的差异。CpGST1和CpGST2都在血淋巴中的表达量最低,其次是闭壳肌和外套膜,而在肝胰脏中的表达量最高。经嗜水气单胞菌刺激后,两个基因在血细胞和肝胰脏中的表达都表现出显著或极其显著差异。本文还将基因扩增产物和表达载体PET-32a经HindIII、XhoI双酶切之后,连接并成功构建了PET-32a-CpGST2原核表达质粒。将该质粒转入大肠杆菌Rosetta-gami(DE3)中,加IPTG至终浓度为1mmol/L,37℃诱导8 h,得到大量融和蛋白,用Ni2+亲和层析镍柱纯化,并测得其纯化蛋白的活性为46.965±0.082μmoL/min/mg。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4;Q78
【部分图文】：
图 1-2GST-μ 和 GST-ζ 的二聚体图[15]Fig 1-2. Dimer of GST-μ and GST-ζ1.4 谷胱甘肽硫转移酶（GST）的功能谷胱甘肽 S-转移酶 (Glutathione S-transferases，GST) 是解毒作用的同工酶[16]，构成了重要生理功能的二聚体胞质同工酶家族，在抗毒机制的第 II 阶段起作用，因此又称为 II 解毒酶[17-18]。GST 还具有非硒依赖性谷胱甘肽过氧化酶的活性，能清除脂类自由基，将有毒的过氧化物转变成低毒的醇类物质，从而起到阻断脂质过氧化的作用[19]。此外，GST 还可以促使白三烯和前列腺素的转化[20]。（1）解毒作用谷胱甘肽 S-转移酶的作用机理主要以解毒作用为主，它是促使还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的活性基团 巯基与毒素结合，生成亲电子络合物，将原有的疏水化合物转变成亲水化合物，并诱导产生同工酶，对外源毒素物
9图 1-3 GST 对 15d-PGJ2信号的衰减[47-50]。图中所示为 15d-PGJ2合成和活性可能被前列腺素影响的各种转录因子。Attenuation of 15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2 signaling by GST. Thisfigure showsis of 15d-PGJ2and the various transcription factors whose activity may be influencedthe prostaglandin[47-50].研究的目的和意义国淡水资源广阔，水产养殖业也很繁盛，由于贝类具有较高的经济价类养殖业在我国水产养殖业中占有很大的比例，主要的贝类有褶纹冠蚌和池蝶蚌等，它们主要用来培育珍珠、食用、制药和制作鱼类和家禽是，由于水环境的污染和疾病易发等状况，在养殖过程中蚌容易大量
15图 2-1 图 2-1 SMART 技术原理图（引自 Clontech 技术手册）。注：CDS 引物、SmartⅡ寡核苷酸、PCR 引物都有一段相同的序列。Fig. 2-1 Theory chart of SMART technology (from Clontech technical manual).Note：The CDS, SmartⅡ oligonucleotide and PCR primers contained a stretch of identicalsequence.2.4.3 感受态（DH5α）的制备（1）挑取 DH5 固体培养基上的单菌落，放在 1.5 ml 的不含抗性的液体养基中，200 r/min、37 ℃震荡培养 12 h。（2）将摇浑浊的菌液倒入 50 ml 不含抗性的液体培养基中，200 r/min、37 震荡培养 3 h，测得其 OD 值为 0.567。（3）将液体培养基分装于 1.5 ml 的离心管中，每管 1 ml，冰上放置 1 h.
【参考文献】
本文编号：2878339
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：S917.4;Q78
【部分图文】：
图 1-2GST-μ 和 GST-ζ 的二聚体图[15]Fig 1-2. Dimer of GST-μ and GST-ζ1.4 谷胱甘肽硫转移酶（GST）的功能谷胱甘肽 S-转移酶 (Glutathione S-transferases，GST) 是解毒作用的同工酶[16]，构成了重要生理功能的二聚体胞质同工酶家族，在抗毒机制的第 II 阶段起作用，因此又称为 II 解毒酶[17-18]。GST 还具有非硒依赖性谷胱甘肽过氧化酶的活性，能清除脂类自由基，将有毒的过氧化物转变成低毒的醇类物质，从而起到阻断脂质过氧化的作用[19]。此外，GST 还可以促使白三烯和前列腺素的转化[20]。（1）解毒作用谷胱甘肽 S-转移酶的作用机理主要以解毒作用为主，它是促使还原型谷胱甘肽（Glutathione，GSH）的活性基团 巯基与毒素结合，生成亲电子络合物，将原有的疏水化合物转变成亲水化合物，并诱导产生同工酶，对外源毒素物
9图 1-3 GST 对 15d-PGJ2信号的衰减[47-50]。图中所示为 15d-PGJ2合成和活性可能被前列腺素影响的各种转录因子。Attenuation of 15-deoxy-△12,14-prostaglandin J2 signaling by GST. Thisfigure showsis of 15d-PGJ2and the various transcription factors whose activity may be influencedthe prostaglandin[47-50].研究的目的和意义国淡水资源广阔，水产养殖业也很繁盛，由于贝类具有较高的经济价类养殖业在我国水产养殖业中占有很大的比例，主要的贝类有褶纹冠蚌和池蝶蚌等，它们主要用来培育珍珠、食用、制药和制作鱼类和家禽是，由于水环境的污染和疾病易发等状况，在养殖过程中蚌容易大量
15图 2-1 图 2-1 SMART 技术原理图（引自 Clontech 技术手册）。注：CDS 引物、SmartⅡ寡核苷酸、PCR 引物都有一段相同的序列。Fig. 2-1 Theory chart of SMART technology (from Clontech technical manual).Note：The CDS, SmartⅡ oligonucleotide and PCR primers contained a stretch of identicalsequence.2.4.3 感受态（DH5α）的制备（1）挑取 DH5 固体培养基上的单菌落，放在 1.5 ml 的不含抗性的液体养基中，200 r/min、37 ℃震荡培养 12 h。（2）将摇浑浊的菌液倒入 50 ml 不含抗性的液体培养基中，200 r/min、37 震荡培养 3 h，测得其 OD 值为 0.567。（3）将液体培养基分装于 1.5 ml 的离心管中，每管 1 ml，冰上放置 1 h.
【参考文献】
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本文编号：2878339
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