L-色氨酸和褪黑激素对中华绒螯蟹血糖代谢及免疫性能的影响

发布时间：2020-11-11 04:20

　　 中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)俗称河蟹、毛蟹和大闸蟹,是一种分布广泛的淡水养殖经济品种。中华绒螯蟹因其味道鲜美而驰名中外、备受青睐,其富含的巨大经济价值也使它名正言顺地成为我国的名特优水产品。近年来,由于中华绒螯蟹的市场需求量日益增长,价格也节节攀升,养殖户们开始争相扩大养殖规模和提高集约化程度,但与此同时也给中华绒螯蟹的养殖业带来了巨大挑战。一系列问题如农药、抗生素的滥用、养殖环境恶化和宿主免疫疲劳等给中华绒螯蟹的养殖带来了极大损失。为了推行健康养殖的理念,我们探究了饲料中添加不同水平的L-色氨酸及其代谢产物——褪黑激素对中华绒螯蟹的血糖代谢及免疫性能的影响,并结合对肠道内菌群多样性的研究,以期为中华绒螯蟹的健康养殖奠定理论基础。(1)投喂中华绒螯蟹4组不同L-色氨酸添加量的饲料(L-色氨酸占比分别为0.36%、0.47%、0.73%和1.05%,分别记为第1、2、3和4组)30天后,测定血糖代谢相关指标、糖酵解反应过程中主要限速酶在组织中的表达量及血清和肝胰腺抗氧化和免疫相关指标。结果显示:饲料中添加不同含量的L-色氨酸对中华绒螯蟹血糖水平无显著影响(P0.05),平均约为4.62 mmol/L。随着饲料中L-色氨酸添加量的增加,肝胰腺糖原含量呈上升趋势,其中第4组蟹肝糖原含量显著高于第1组(P0.05)。此外,在对中华绒螯蟹糖原磷酸化酶活性进行测定分析时发现L-色氨酸对其影响并不显著(P0.05)。采用荧光定量PCR分别探究了丙酮酸激酶(Pyruvate kinase,PK)和糖原合成酶激酶3(Glycogen synthase kinase 3,GSK3)在中华绒螯蟹十种不同组织(眼柄、胸神经节、脑神经节、肠、肝胰腺、胃、心、血、肌肉和鳃)中的表达情况,发现均有表达但不同组织间的相对表达量差异显著(P0.05)。PK mRNA在心脏组织中的相对表达量最高,显著高于其他组织(P0.05),而在眼柄中表达最低。GSK3 mRNA在胸神经节中的相对表达量最高,显著高于其他组织(P0.05),同样的也是在眼柄中表达最低。此外,我们还分析了不同L-色氨酸饲料投喂后,中华绒螯蟹PK和GSK3 mRNA在4种不同组织中的表达情况。结果发现:中华绒螯蟹心脏和脑神经节中PK mRNA的相对表达量无明显变化(P0.05)。但在胸神经节和肌肉组织中,随着饲料中L-色氨酸添加量的增加,PK mRNA的相对表达量也显著上升(P0.05)。同样地,各组蟹脑神经节中GSK3 mRNA的相对表达量也无显著变化(P0.05),而随着饲料中L-色氨酸含量的提高,胸神经节、心脏和鳃组织中GSK3 mRNA的相对表达量较对照组而言有显著提高(P0.05)。不同L-色氨酸饲料投喂后,中华绒螯蟹血清T-AOC、T-SOD和ACP活力及肝胰腺T-AOC均未发生显著变化(P0.05),但血清CAT和AKP活性却随着L-色氨酸添加量的增加而呈上升趋势。其中,第4组中华绒螯蟹血清的CAT和AKP活性显著高于第1组(P0.05)。摄食试验组饲料后中华绒螯蟹的肝胰腺T-SOD活性显著高于对照组(P0.05)。此外,第3和4组中华绒螯蟹的肝胰腺CAT活性显著高于第1和2组(P0.05),其中第1组蟹的CAT活性在数值上最低。(2)通过高通量测序技术,对4组L-色氨酸饲料投喂后的中华绒螯蟹的肠道内微生物进行了16S rRNA V3-V4区扩增,经Illumina平台测序发现,饲料中添加L-色氨酸能够显著提高肠道菌群的丰富度和多样性。中华绒螯蟹肠内主要的优势菌为柔膜菌门(Tenericutes)、变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)及放线菌门(Actinobacteria)。饲料中添加L-色氨酸能够显著提高中华绒螯蟹肠道内变形菌门、厚壁菌门和放线菌门的丰度。这些菌群均为优势菌,对中华绒螯蟹的免疫力有一定的促进作用。(3)探究褪黑激素(Melatonin,MT)对中华绒螯蟹血糖代谢和血清及肝胰腺抗氧化和免疫水平的影响。首先,研究眼柄对血糖调节的作用,通过切除中华绒螯蟹单侧或双侧眼柄后发现,眼柄切除尤其是双侧眼柄切除能够显著降低中华绒螯蟹的血糖水平(P0.05)。无论中华绒螯蟹眼柄切除与否,注射MT均能显著诱导高血糖症并呈剂量依赖性的方式增加。其中,注射10~-66 mole/只的MT较其他剂量(10~(-12),10~(-10),10~(-9),10~(-8)和10~(-7) mole/只)而言对血糖水平的影响更为明显。RT-PCR反应显示中华绒螯蟹十种不同组织(眼柄、胸神经节、脑神经节、肠、肝胰腺、胃、心、血、肌肉和鳃)中CHH mRNA的相对表达量存在组织特异性。基于CHH mRNA在上述组织中的相对表达量,选择眼柄、胸神经节、肠和血淋巴这四个组织用于后续探究注射MT对中华绒螯蟹CHH mRNA相对表达量的影响。结果显示:较眼柄完整组而言,双侧眼柄切除导致中华绒螯蟹胸神经节、肠和血淋巴组织中CHH mRNA的相对表达量得到显著提升(P0.05)。和对照组相比,不论眼柄是否切除,注射MT均能显著提高眼柄、胸神经节和肠道组织中的CHH mRNA相对表达量(P0.05)。此外,MT的注射还导致中华绒螯蟹的肝胰腺及肌肉中总碳水化合物(TCHO)和糖原含量的显著降低,而糖原磷酸化酶(a和b)活性却明显提高(P0.05)。切除中双侧眼柄对华绒螯蟹血清T-AOC、T-SOD和ACP活性没有显著影响(P0.05),但CAT和AKP活性较眼柄完整组而言则显著降低(P0.05)。不仅如此,肝胰腺T-SOD和CAT活性也显著降低(P0.05)。一方面对眼柄完整组而言,注射MT能够显著提高血清T-SOD、CAT、ACP和AKP活性(P0.05),对T-AOC未有明显影响(P0.05)。另一方面,对双侧眼柄切除组而言,在注射MT2h后,中华绒螯蟹血清T-AOC、T-SOD、CAT、ACP和AKP活性显著提高(P0.05),除此之外,肝胰腺T-SOD和CAT活性也显著提高(P0.05)。但是,无论眼柄切除与否,注射MT均未对血清及肝胰腺T-AOC造成显著差异。上述结果表明:饲料中L-色氨酸的添加量对血糖水平的影响并不明显,但能显著提高中华绒螯蟹的抗氧化及免疫能力。此外,饲料中添加L-色氨酸还能丰富中华绒螯蟹肠道内的优势菌群,有助于机体防御病害。L-色氨酸的代谢产物——MT能够诱导中华绒螯蟹的高血糖症,且不一定受眼柄组织中的CHH所调控。此外,MT还能适当地提高中华绒螯蟹机体的抗氧化能力。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：

3-dioxygenase, TDO）和吲哚 2, 3-双加氧酶（Indoleamine 2,enase, IDO）这两种限速酶作用下进行代谢，最后经多级酶促反应生成喹uinolinic acid, QA）等活性分子[6]。代谢途径如图 1-1 所示：

从图 2-1 和 2-2 中可以看出，PK 和 GSK3 mRNA 在这十，但表达水平不尽相同。其中，PKmRNA 在心脏组织的表达量著高于其他组织（P<0.05）；在眼柄组织中表达最低。因此，在我们选择表达量较高的前四个组织，分别为心脏、胸神经节、脑，用于后续分析。此外，GSK3mRNA 在胸神经节中的表达量最其他组织（P<0.05），同样的也是在眼柄中表达最低。关于 GSK3出表达量较高的前四个组织（心脏、胸神经节、脑神经节和鳃）

图 2-2 中华绒螯蟹 GSK3 mRNA 在不同组织中的相对表达情况The relative expression content of E. sinensis GSK3 mRNAin different tissuS.E., n=8)上述方法分析了 4 种不同组织中 PK 和 GSK3 mRNA 在不同 L达量的变化情况。结果显示：4 种饲料投喂下，中华绒螯蟹心脏
【参考文献】

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本文编号：2878735