克氏原螯虾三个免疫相关基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究
发布时间：2020-11-16 15:53
克氏原螯虾(Procambarus clarkii),俗称小龙虾、红螯虾等,其食性杂、生长快且适应力极强,自上世纪三十年代传入我国,因肉质鲜美而深受人们喜爱,之后快速占据淡水虾类经济产业的重要地位,现已成为世界上商品价值最大的虾类之一。十几年前南京的“龙虾门”事件,使人们对克氏原螯虾的病害情况开始有了重视,也吸引了越来越多的科研人士着手研究其染病、抗病等内容。另外,随着人们对克氏原螯虾的热情进一步高涨,供不应求的情况时有发生,这就迫使养殖户更大规模地进行养殖,随之而来的也是克氏原螯虾患病几率的增加及感染病原体的多样;而克氏原螯虾同其他无脊椎动物一样,仅依靠先天免疫来防御病原入侵,因此对克氏原螯虾先天免疫的研究更显得尤为重要。本课题研究了Caspase-3C、Lectin和LGBP三种重要的免疫基因在克氏原螯虾体内的免疫功能,并得到以下结果:1、在克氏原螯虾体内克隆到一种半胱氨酸蛋白酶基因,命名为PcCaspase-3C,该基因全长4684 bp,其包含一个1572 bp的开放阅读框(ORF),编码523个氨基酸。该蛋白含有一个由237个氨基酸组成的CASc结构域和一个低复杂度区域。该基因主要表达于心脏、胃和肠道,在肝胰腺和鳃中表达量较低,在血细胞中表达最少。受金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或白斑综合征病毒(WSSV)刺激后,PcCaspase-3C在肠、胃中的表达水平均有不同程度的上调。将该基因干扰后,再用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾,发现有部分抗菌肽的表达被抑制,如ALF2、ALF5、ALF6、Cru4和Lys。将该基因敲低后,用WSSV感染克氏原螯虾,WSSV的拷贝数有明显增加。根据以上结果,推测PcCaspase-3C在克氏原螯虾抗细菌和抗病毒免疫应答中发挥重要作用。2、C型凝集素作为一类模式识别受体(PRRs)在甲壳动物的先天免疫中发挥重要作用。在本研究中,我们在克氏原螯虾中发现了一种新的凝集素基因(PcLectin),该基因全长1025 bp,包括528 bp的ORF,编码175个氨基酸的蛋白。PcLectin蛋白含有一个信号肽和一个糖识别结构域(CRD)。该基因在胃中表达水平最高,在肝胰腺中表达较少,在其他组织中几乎不表达。在感染金黄色葡萄球菌、副溶血弧菌或WSSV的虾中,PcLectin的表达均出现不同程度的上调。将该基因敲低后,用副溶血弧菌刺激克氏原螯虾,部分抗菌肽的表达被抑制(ALF2、ALF6、Cru2、Cru4)。将该基因进行体外原核重组表达,发现重组表达的蛋白对几种革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和多糖均具有结合活性,且能以Ca~(2+)依赖的方式凝集细菌。综合以上结果,我们认为,PcLectin参与了克氏原螯虾先天免疫防御。3、脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白(LGBP)作为一种模式识别受体,参与无脊椎动物先天免疫。本研究中,我们在克氏原螯虾体内克隆到一个LGBP基因,全长1327 bp,包括1113 bp的ORF,编码由370个氨基酸残基组成的蛋白质,其含一个信号肽、一个糖苷水解酶活性结构域(Glyco_hydro_16)和一个低复杂度区域。经过研究,发现该基因在不同组织中的表达存在性别差异,在健康的克氏原螯虾体内,在雌虾各种组织中的表达量几乎都低于雄虾。无论是雌虾还是雄虾,都是在肝胰腺中表达最高,其他组织中表达较少,肠道中表达最少。经副溶血弧菌或脂多糖(LPS)刺激后,该基因在雌体和雄体中的变化情况亦有差异,但在胃和肝胰腺中的表达整体呈上升趋势。在雄虾的肝胰腺中,将PcLGBP基因敲低后,多种抗菌肽基因的表达都受到抑制。体外重组表达的LGBP蛋白(rPcLGBP),对LPS、Glu和PGN都有不同程度的结合活性,并且可以结合多种革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。酚氧化酶活性测定实验结果表明,在正常雄虾的肝胰腺、鳃和胃中,其酚氧化酶活性均显著高于雌虾。在雄虾肝胰腺中,将PcLGBP敲低后,酚氧化酶活性降低。重组的LGBP蛋白和β-1,3-葡聚糖(Glu)或LPS孵育后可以明显提高肝胰腺的酚氧化酶活性。以上结果表明LGBP不仅可以参与抗菌肽基因的表达调控,还可以参与酚氧化酶的活化;在雄虾体内,其表达水平较高,赋予雄虾较高的酚氧化酶活性。
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
第一章 绪 论得尤为重要[25]。如图 1.1 所示，当模式识别受体识别病原微生物表面的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，Glu）等多糖时[26-28]，广泛存在于血液和甲壳内层组织中的酚氧化酶原便被特异性激活，并被水解为有活性的酚氧化酶，进而促进单酚逐步氧化成联苯酚和具有毒性的醌，而醌会自发地生成黑色素，并与黑色素一起参与防御反应，杀灭入侵的病原，[22,29]；其中防御过程包括提供调节因子、促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节的形成[25]，同时也可以介导凝集和凝固，产生杀菌物质（溶菌酶等）[30]。这种反应非常剧烈且高效，机体为了防止错误地合成有毒物质醌，也发展出很严密的调控机制。在甲壳动物体内，酚氧化酶原主要由成熟血细胞（颗粒细胞或半颗粒细胞）产生并贮存，一旦被微生物表面的多糖或者脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白、β-葡聚糖结合蛋白等触发，就会以脱颗粒的方式释放到血浆中，随后被水解并在短时间内产生大量的级联反应，其中蛋白酶抑制剂可以限制这种级联反应，从而确保此反应不会因为过早或过激发生而危害机体[29, 31]。
起始 caspase 再对执行者 caspase 进行切割并使之激活，被激活的执行者 caspase对 caspase 靶蛋白进行水解，最终导致细胞的程序性死亡（图 1.2）。在大多数生物体中，细胞凋亡是抵御病原菌、维持细胞正常稳态的重要生物学过程之一[65, 73]。细胞凋亡通常由两种途径引起，一种是 caspase-8 介导的外源性凋亡通路，另一种是 caspase-9 激活介导的内源性凋亡通路，两者都能激活caspase-3[71,74,75]。然而，只有一部分病原体会被凋亡通路抑制其复制，而另一部分可能已经进化出一些防御和反应机制，不会受到凋亡的影响[73,76-79]。在无脊椎动物中。一些研究人员发现，虾感染对虾白斑综合征病毒（WSSV）之后，其体内的 caspase-3 基因的活性大幅增加[80]。比如墨吉明对虾感染 WSSV 后，其caspase-3 基因表达水平有一定提升[81]；日本囊对虾体内的 PjCaspase 基因在病毒感染后表达上调，被敲除后，其诱导的细胞凋亡受到明显抑制[76]。据报道，经病原微生物感染后，虾体中可检测到大规模的细胞凋亡，这种凋亡的增加最终会导致虾体的死亡[80, 82, 83]。一些研究证实，消除 caspase 活性可以减少细胞凋亡[84]，而 caspase-3 是细胞凋亡的重要调控元件[69]，所以敲除 Caspase-3 可能会提高虾的存活率[79]。
第二章 克氏原螯虾体内 Caspase-3C 基因的克隆与功能研究Fig. 2.1 (A-B) Nucleotide and deduced amino acid sequence of PcCaspase-3C from P. clarkii.Deduced amino acid residues are numbered on the right. Alow complexity region sequence isunderlined, and the CASc domain is in gray. The initiation codon (ATG) is marked in red. (C)Domain structure of PcCaspase-3C.标记。（C）PcCaspase-3C 的结构域示意图。
【相似文献】
本文编号：2886415
【学位单位】：南京师范大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S917.4
【部分图文】：
第一章 绪 论得尤为重要[25]。如图 1.1 所示，当模式识别受体识别病原微生物表面的脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）、肽聚糖（peptidoglycan，PGN）、β-1,3-葡聚糖（β-1,3-glucan，Glu）等多糖时[26-28]，广泛存在于血液和甲壳内层组织中的酚氧化酶原便被特异性激活，并被水解为有活性的酚氧化酶，进而促进单酚逐步氧化成联苯酚和具有毒性的醌，而醌会自发地生成黑色素，并与黑色素一起参与防御反应，杀灭入侵的病原，[22,29]；其中防御过程包括提供调节因子、促进血细胞吞噬作用、包囊作用和结节的形成[25]，同时也可以介导凝集和凝固，产生杀菌物质（溶菌酶等）[30]。这种反应非常剧烈且高效，机体为了防止错误地合成有毒物质醌，也发展出很严密的调控机制。在甲壳动物体内，酚氧化酶原主要由成熟血细胞（颗粒细胞或半颗粒细胞）产生并贮存，一旦被微生物表面的多糖或者脂多糖-β-1,3-葡聚糖结合蛋白、β-葡聚糖结合蛋白等触发，就会以脱颗粒的方式释放到血浆中，随后被水解并在短时间内产生大量的级联反应，其中蛋白酶抑制剂可以限制这种级联反应，从而确保此反应不会因为过早或过激发生而危害机体[29, 31]。
起始 caspase 再对执行者 caspase 进行切割并使之激活，被激活的执行者 caspase对 caspase 靶蛋白进行水解，最终导致细胞的程序性死亡（图 1.2）。在大多数生物体中，细胞凋亡是抵御病原菌、维持细胞正常稳态的重要生物学过程之一[65, 73]。细胞凋亡通常由两种途径引起，一种是 caspase-8 介导的外源性凋亡通路，另一种是 caspase-9 激活介导的内源性凋亡通路，两者都能激活caspase-3[71,74,75]。然而，只有一部分病原体会被凋亡通路抑制其复制，而另一部分可能已经进化出一些防御和反应机制，不会受到凋亡的影响[73,76-79]。在无脊椎动物中。一些研究人员发现，虾感染对虾白斑综合征病毒（WSSV）之后，其体内的 caspase-3 基因的活性大幅增加[80]。比如墨吉明对虾感染 WSSV 后，其caspase-3 基因表达水平有一定提升[81]；日本囊对虾体内的 PjCaspase 基因在病毒感染后表达上调，被敲除后，其诱导的细胞凋亡受到明显抑制[76]。据报道，经病原微生物感染后，虾体中可检测到大规模的细胞凋亡，这种凋亡的增加最终会导致虾体的死亡[80, 82, 83]。一些研究证实，消除 caspase 活性可以减少细胞凋亡[84]，而 caspase-3 是细胞凋亡的重要调控元件[69]，所以敲除 Caspase-3 可能会提高虾的存活率[79]。
第二章 克氏原螯虾体内 Caspase-3C 基因的克隆与功能研究Fig. 2.1 (A-B) Nucleotide and deduced amino acid sequence of PcCaspase-3C from P. clarkii.Deduced amino acid residues are numbered on the right. Alow complexity region sequence isunderlined, and the CASc domain is in gray. The initiation codon (ATG) is marked in red. (C)Domain structure of PcCaspase-3C.标记。（C）PcCaspase-3C 的结构域示意图。
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相关硕士学位论文 前1条
1 韩珂珂;克氏原螯虾三个免疫相关基因Caspase-3C、Lectin和LGBP的功能研究[D];南京师范大学;2019年
本文编号：2886415
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