斑节对虾miR-7562介导下ATG5-ATG12共轭系统应答哈维弧菌胁迫的作用机制研究

发布时间：2020-11-20 23:58

　　 斑节对虾(Penaeus monodon)具有味道鲜美、营养丰富、成长快等特点,目前为东南亚海域及中国南海海域重要养殖经济水产种类。但近年来由于海洋环境污染日趋严重,水体微生物等物质经常严重超标,致使斑节对虾的养殖产业发展因此受到严重影响。其中哈维弧菌是一种广泛存在于海洋环境中可以感染甲壳类、鱼类、贝类的条件致病菌,易引发突眼、慢性皮肤溃疡、败血症等动物病症,而细胞自噬可吞噬细菌或者病毒,对细胞免疫有重要的意义。在细菌与宿主互作中基因表达调控起非常重要的作用,miRNA是调控基因表达的重要因子,故研究miRNA调控细胞自噬基因在哈维弧菌刺激下的作用就很有意义。本实验利用已构建的斑节对虾转录组数据库筛选出ATG5和ATG12 EST序列,用primer软件设计特异性引物,PCR进行ORF验证,利用RACE技术扩增得到ATG5和ATG12基因的3’末端,以此得到两个基因的全长。确定了斑节对虾ATG5和ATG12基因在不同组织中的表达分布规律;对靶向调控ATG5和ATG12的miRNA进行了筛选,并利用双荧光素报告实验进行了验证;利用荧光定量PCR的方法及western blot免疫印迹等方法对ATG5、ATG12与miR-7562在哈维弧菌应激下的表达调控关系进行了研究,并初步对由哈维弧菌应激所产生的细胞自噬、miR-7562及ATG5-ATG12共轭系统之间关联情况进行了鉴定,具体研究结果如下:(1)PmATG5基因序列cDNA主要为5’-UTR包含114 bp、1357 bp 3’-UTR和一个编码269个氨基酸的810 bp开放阅读框。PmATG5分子量为31.125 kDa,其理论等电点为5.66。PmATG12基因序列cDNA全长1101bp,包含363 bp的ORF,16 bp的5’-UTR和722 bp的3’-UTR。开放阅读框编码120个氨基酸,分子量为13.59 kDa,理论等电点为6.12。PmATG5和PmATG12在斑节对虾各个组织中均有表达,在肌肉组织中表达量最高,且两者的表达模式有一定的相似性。序列比对结果显示,PmATG5氨基酸序列与蓝蟹的ATG5一致性高达87%,PmATG12的序列则与家蚕有较高的一致性。表明两者在进化上都高度保守,ATG5和ATG12对机体有十分重要的作用。(2)miRNA的筛选:靶基因预测使用的为mireap,miranda,targetscan三个软件,miRNA靶基因预测的结果是取三个软件的交集。从本实验室已有的小RNA文库筛选调控ATG5和ATG12的miRNA,共有22种miRNA调控ATG5,有24种miRNA调控ATG12,共同调控PmATG5和PmATG12基因的有三种,分别是mir-7562,mir-8485,mir-278。当斑节对虾受到哈维弧菌刺激时,miR-278和miR-7562在6h和24h均有明显的下调,PmATG5的相对表达量在72h达到最高,约为对照组的3.8倍,而PmATG12的相对表达量在哈维弧菌应激72h时达到最高,约为对照组的1.6倍,miRNA的表达与PmATG5和PmATG12表达呈负相关。双荧光素报告结果显示:miR-7562可以调控带有ATG5 3’UTR的荧光素的表达(p0.0001);而在结合位点突变后,这种调控关系减弱(p=0.0022),减弱9.3%。由此证实miR-7562可能通过该结合位点调控荧光素的表达。miR-7562可以调控带有ATG12 3’UTR的荧光素的表达(p0.0001);而在结合位点突变后,这种调控关系明显减弱(p=0.0246),减弱46.2%。miR-7562可以调控带有ATG5 3’UTR的荧光素的表达和ATG12 3’UTR的荧光素的表达。(3)miRNA通过调节ATG5、ATG12的转录水平介导细胞自噬。过量表达miR-7562可使PmATG5在24h和48h的相对表达量下调,约为对照组的0.67倍和0.81倍,可使PmATG12相对表达量明显下调,在24h时约为对照组的0.62倍;沉默miR-7562可使PmATG5和PmATG12相对表达量上调,分别在24h显著高于对照组2.2倍和1.43倍。免疫印迹结果显示:过量表达miR-7562后,在48h斑节对虾细胞自噬水平下降;沉默miR-7562后,在48h斑节对虾细胞自噬水平明显升高。(4)哈维弧菌刺激下,miR-7562调节的PmATG5和PmATG12在细胞自噬中的作用。荧光定量PCR结果显示斑节对虾受到哈维弧菌刺激后,过表达miR-7562(miR-7562-agomir)的斑节对虾的PmATG5的相对表达量在24h与(V.harveyi+NCM)对照组相比明显下调,而PmATG12相对表达量在注射6h和24h时与(V.harveyi+NCM)组相比表现下调,蛋白定量结果表明,斑节对虾的细胞自噬较对照组相比在48h和72h明显下调;沉默miR-7562(miR-7562-antagomir)的斑节对虾的PmATG5在24h相对表达量与(V.harveyi+NCI)对照组比明显上调,而PmATG12在注射6h和24h时与(V.harveyi+NCM)对照组相比相对表达量表现上调,蛋白定量结果表明,斑节对虾在48h、72h细胞自噬程度较对照组明显上调。在哈维弧菌刺激下,无论是干扰ATG5/ATG12单个基因的表达,还是同时干扰ATG5和ATG12的表达,细胞自噬水平较对照组都明显下调。种种结果都表明,miR-7562调控的细胞自噬相关基因ATG5和ATG12在哈维弧菌刺激斑节对虾下调控其细胞自噬。
【学位单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：S945.47
【部分图文】：

图 1-1 细胞自噬形成过程 自噬体伸长过程中，Atg5-Atg12 占据重要位置，从自噬体，自噬体膜不断延长，至包裹并封闭邻近的目标及胞浆，然后与溶酶体融合后吞噬物质δ两类泛素共轭体系参与自噬体的扩，即 lc3-PE 和 ATG5-ATG12 共轭体Figure 1-1.The process of the formation of autophagy. ATG5 is one of the key players dautophagosome elongation. Starting from the autophagosome formation site, the autophagelongated, sealed around neighboring targets, and then fused with a lysosome to allowdegradation of the engulfed contents. Two ubiquitin-like conjugation systems are involveexpansion of autophagosome: ATG5-ATG12 and LC3-PE1.4 miRNA 简介miRNA(microRNA)是近年来研究非常多的一类非编码小 RNA（ncRN估计，miRNA 能够在翻译水平上调节人类基因组中高达 60%的基因编码的由于 miRNA 在基因调控中的普遍作用，它们参与到许多生理过程，如分化

图 2-5 PmATG12 系统进化树δ使用 Clustal W 及 MEGA6 多重比对并建立 NJ 进化树δ相关ATG12 GenBank 注册号如下：黑脉金斑蝶 Danaus plexippus EHJ78946.1, 家蚕 Bombyx moriNP_001135963.1, 桦尺蛾 Biston betularia ADO32996.1, 斑马鱼 Danio rerio AAI54047.1, 美国短吻鳄 Alligator mississippiensis KYO48830.1, 斑胸草雀 Taeniopygia guttata ACH43616.1δFig.2-5 Phylogenetic analyses of PmATG12. Amino acid sequences alignment were producedby Clustal W, and we used the MEGA 6 to build neighbor-joining phylogeny tree. GenBankaccession numbers encoding ATG12 are as follows: Danaus plexippus EHJ78946.1, Bombyx moriNP_001135963.1, Biston betularia ADO32996.1,Danio rerio AAI54047.1, Alligatormississippiensis KYO48830.1, Taeniopygia guttata ACH43616.1。PmATG5 氨基酸序列显示其与蓝蟹（CAJ31266.1）的 ATG5 一致性高达 87%，与内华达古白蚁（KDR09853.1，61%），膜翅蜜蜂（KOX80344.1，59%）等也有很高的一致性(图 2-6)。PmATG12 与家蚕（NP_001135963.1，71%）有较高的一致性，和桦尺蛾(ADO32996.1，65%)，斑胸草雀（ACH43616.1，60%）均有很高同源性（图 2-6）。

di斑节对虾与其他物种ATGS氛基酸多重比对，相关物种名称和注册号见图2-5.Fig.2-6Multiplealignmentsofthededuceda
【参考文献】

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本文编号：2892206