壳聚糖和山莨菪碱可有效提高鳜灭活传染性脾肾坏死病毒疫苗的免疫保护效能
发布时间：2020-12-23 12:35
鳜（Siniperca chuatsi）是我国优质淡水鱼的重要品种,但随着鳜养殖技术问题的解决和养殖规模的逐年扩大和养殖密度的提高,严重的病害问题已成为限制鳜养殖业发展的主要瓶颈。特别是1994年起由传染性脾肾坏死病毒（Infectious spleen and kidney necrosis virus,ISKNV）引起的鳜虹彩病毒病最为严重。因此,对其开展深入研究以及免疫防控研究意义重大。病毒灭活疫苗因具有制备简便、免疫效果稳定、研发周期短等优势而成为最具产业前景的疫苗之一。而有效的免疫佐剂可以提高病毒灭活疫苗的特异性免疫应答,因此对ISKNV病毒灭活疫苗进行免疫佐剂的筛选是十分必要的。在这项研究中,首先从鳜ISKNV感染下制备了灭活病毒疫苗,选择了壳聚糖、poly（I:C）、山莨菪碱和ims1312四种佐剂分别于疫苗混合后进行注射免疫,随后为了研究佐剂增强疫苗的保护效果,分别进行了病理学组织切片,血清中酶活动力学检测,qRT-PCR和个体死亡率实验。主要的研究结果如下:1.壳聚糖佐剂显著增强ISKNV感染后疫苗对肝脾保护效果在病毒攻毒后第7天对每个处理组的肝脏和脾脏分别取样,制备...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１病鳜脾脏细胞的病毒电镜?阁１－２病毒颗粒在电镜观察下呈??１８
为了探索ＩＳＫＮＶ在体内感染后鳜的病理表观变化和各器官的解剖变??化，共分为对照组与感染组，观察两组间的变化，结果表明，对照组和感染组两??组间出现显著差异（图３－１?），从图中可以发现对照组和感染组之间出现了明显区??别，图３－１Ａ所示感染组鳃盖底部出现了明显的出血现象，这是鳜感染了?ＩＳＫＮＶ??的表观明显症状。分别对两组鱼进行解剖后观察，腹腔内各个器官也出现了明显??的病理变化，其中打开鳃盖后发现，与对照组相比感染组的鳃丝明显的肿胀发白??（图３－１Ｂ）；同时发现腹腔内的肝脏也发白肿胀并带有弥散化症状（图３－１Ｃ）；??当观察到中肾器官时，感染组相比对照组中肾出现明显的肿胀充血，这是由于病??毒侵入时中肾作为免疫器官和代谢器官被破坏出现的典型症状（图３－１Ｄ）；并且??我们观察到打开腹腔时对照组的腹腔内各组织正常且并没有出现黄色腹水，而感??染组作为很明显的黄色腹水是ＩＳＫＮＶ感染的明显症状（图３－１Ｅ）。随后对病鱼??的组织混合后提取ＤＮＡ进行ＩＳＫＮＶ的分子水平检测，通过与阳性对照的对比??发现病鱼组织中存在明显的ＩＳＫＮＶ条带（图３－１Ｆ，?Ｇ）。以上结果均证明ＩＳＫＮＶ??对于鳜的感染明显成功
病毒灭活疫苗的安全性。从图中我们可以看出，经过７２?ｈ的恒温培养后，观察??到ＬＢ固体培养板没有出现杂菌菌落，也没有出现大量的真菌，用于验证制备的??病毒灭活疫苗并没有混合其他的杂菌，排除了细菌对实验的影响（图３－２Ａ）。在??荧光定量实验中，为了使定量结果准确，对荧光定量ＰＣＲ的目标基因进行引物??检测，必须使定量的引物形成单一条带，于是分别对内参基因伽和ＴＴＶＦ－ｃｔ、??／ｇＭ、吻以及ＺＳ幻ＶＫ－Ｗ７基因进行定量引物凝胶电泳检测，如图所示，五个定??量基因的条带均单一清晰，这为后面的实验奠定了基础（图３－２?８，（：，０，艮［）．??ｍｍ??焉函層｜｜＿??２５０ｂｐ?２５０ｂｐｆＹ?Ｙ?ｆ??ｌＯＯｂｐ?ＸＳＳｂｐ??ＨＨＢＨｉ?ＨｌＨＩＨｌ??图３－２检测定量引物及病毒灭活疫苗安全性。（Ａ）检测疫苗的安全性。（Ｂ）核酸凝胶检测片??（Ｃ）核酸凝胶检测７７＾ａ．?（Ｄ）核酸凝胶检测每Ｍ?（Ｅ）核酸凝胶检测啤ｅｒ／ｗ．?（Ｆ）核酸凝胶检测／５幻不如７．??Ｆｉｇ．?３－２?Ｔｏ?ｄｅｔｅｃｔ?ｔｈｅ?ｓａｆｅｔｙ?ｏｆ?ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ａｎｄ?ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖａｃｃｉｎｅ．?（Ａ）?Ｔｅｓｔ?ｔｈｅ?ｓａｆｅｔｙ??ｏｆ?ｔｈｅ?ＩＳＫＮＶ?ｖａｃｃｉｎｅ．?（Ｂ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｉ－ａｃｔｉｎ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．?（Ｃ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＮＦ－ａ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．??（Ｄ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＩｇＭ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．?（Ｅ）Ｄｅｔｅｃｔｉ
【参考文献】：
期刊论文
[1]大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因的原核表达及重组蛋白的免疫效果初步分析[J]. 马冬梅,邓国成,白俊杰,江小燕,曹婷婷,蔡磊. 生物技术通报. 2016(08)
[2]鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 付小哲,李宁求,林强,刘礼辉,吴淑勤. 水产学报. 2016(03)
[3]同步接毒条件下鳜传染性脾肾坏死病毒在CPB细胞中的最适增殖条件[J]. 罗霞,付小哲,李宁求,林强,张悠,黄志斌. 水产学报. 2015(11)
[4]山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果[J]. 时云朵,任燕,张德锋,付小哲,林强,李宁求,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2015(05)
[5]基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法[J]. 付小哲,李宁求,林强,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2014(09)
[6]鳜鱼传染性脾肾坏死病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 安伟,肖雨,张崇文,张明辉,何正侃. 中国预防兽医学报. 2014(03)
[7]渔用疫苗发展现状及趋势[J]. 吴淑勤,陶家发,巩华,常藕琴,任燕,刘礼辉,陈总会,赖迎迢. 中国渔业质量与标准. 2014(01)
[8]鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析[J]. 付小哲,李宁求,彭媛媛,林强,石存斌,黄志斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2013(02)
[9]动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用[J]. 卫龙兴,王福泉. 现代农业科技. 2009(19)
[10]鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证[J]. 付小哲,李宁求,彭媛媛,石存斌,白俊杰,吴淑勤. 中国水产科学. 2009(03)
硕士论文
[1]鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗检验关键技术研究[D]. 张醴溪.华中农业大学 2017
本文编号：2933726
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：60 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
图１－１病鳜脾脏细胞的病毒电镜?阁１－２病毒颗粒在电镜观察下呈??１８
为了探索ＩＳＫＮＶ在体内感染后鳜的病理表观变化和各器官的解剖变??化，共分为对照组与感染组，观察两组间的变化，结果表明，对照组和感染组两??组间出现显著差异（图３－１?），从图中可以发现对照组和感染组之间出现了明显区??别，图３－１Ａ所示感染组鳃盖底部出现了明显的出血现象，这是鳜感染了?ＩＳＫＮＶ??的表观明显症状。分别对两组鱼进行解剖后观察，腹腔内各个器官也出现了明显??的病理变化，其中打开鳃盖后发现，与对照组相比感染组的鳃丝明显的肿胀发白??（图３－１Ｂ）；同时发现腹腔内的肝脏也发白肿胀并带有弥散化症状（图３－１Ｃ）；??当观察到中肾器官时，感染组相比对照组中肾出现明显的肿胀充血，这是由于病??毒侵入时中肾作为免疫器官和代谢器官被破坏出现的典型症状（图３－１Ｄ）；并且??我们观察到打开腹腔时对照组的腹腔内各组织正常且并没有出现黄色腹水，而感??染组作为很明显的黄色腹水是ＩＳＫＮＶ感染的明显症状（图３－１Ｅ）。随后对病鱼??的组织混合后提取ＤＮＡ进行ＩＳＫＮＶ的分子水平检测，通过与阳性对照的对比??发现病鱼组织中存在明显的ＩＳＫＮＶ条带（图３－１Ｆ，?Ｇ）。以上结果均证明ＩＳＫＮＶ??对于鳜的感染明显成功
病毒灭活疫苗的安全性。从图中我们可以看出，经过７２?ｈ的恒温培养后，观察??到ＬＢ固体培养板没有出现杂菌菌落，也没有出现大量的真菌，用于验证制备的??病毒灭活疫苗并没有混合其他的杂菌，排除了细菌对实验的影响（图３－２Ａ）。在??荧光定量实验中，为了使定量结果准确，对荧光定量ＰＣＲ的目标基因进行引物??检测，必须使定量的引物形成单一条带，于是分别对内参基因伽和ＴＴＶＦ－ｃｔ、??／ｇＭ、吻以及ＺＳ幻ＶＫ－Ｗ７基因进行定量引物凝胶电泳检测，如图所示，五个定??量基因的条带均单一清晰，这为后面的实验奠定了基础（图３－２?８，（：，０，艮［）．??ｍｍ??焉函層｜｜＿??２５０ｂｐ?２５０ｂｐｆＹ?Ｙ?ｆ??ｌＯＯｂｐ?ＸＳＳｂｐ??ＨＨＢＨｉ?ＨｌＨＩＨｌ??图３－２检测定量引物及病毒灭活疫苗安全性。（Ａ）检测疫苗的安全性。（Ｂ）核酸凝胶检测片??（Ｃ）核酸凝胶检测７７＾ａ．?（Ｄ）核酸凝胶检测每Ｍ?（Ｅ）核酸凝胶检测啤ｅｒ／ｗ．?（Ｆ）核酸凝胶检测／５幻不如７．??Ｆｉｇ．?３－２?Ｔｏ?ｄｅｔｅｃｔ?ｔｈｅ?ｓａｆｅｔｙ?ｏｆ?ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ?ｐｒｉｍｅｒｓ?ａｎｄ?ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ?ｖｉｒｕｓ?ｖａｃｃｉｎｅ．?（Ａ）?Ｔｅｓｔ?ｔｈｅ?ｓａｆｅｔｙ??ｏｆ?ｔｈｅ?ＩＳＫＮＶ?ｖａｃｃｉｎｅ．?（Ｂ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ｆｉ－ａｃｔｉｎ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．?（Ｃ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＴＮＦ－ａ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．??（Ｄ）?Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ?ｏｆ?ＩｇＭ?ｂｙ?ｎｕｃｌｅｉｃ?ａｃｉｄ?ｇｅｌ．?（Ｅ）Ｄｅｔｅｃｔｉ
【参考文献】：
期刊论文
[1]大口黑鲈溃疡综合征病毒MCP基因的原核表达及重组蛋白的免疫效果初步分析[J]. 马冬梅,邓国成,白俊杰,江小燕,曹婷婷,蔡磊. 生物技术通报. 2016(08)
[2]鳜传染性脾肾坏死病毒主衣壳蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 付小哲,李宁求,林强,刘礼辉,吴淑勤. 水产学报. 2016(03)
[3]同步接毒条件下鳜传染性脾肾坏死病毒在CPB细胞中的最适增殖条件[J]. 罗霞,付小哲,李宁求,林强,张悠,黄志斌. 水产学报. 2015(11)
[4]山莨菪碱提高嗜水气单胞菌灭活疫苗浸泡免疫鲫的效果[J]. 时云朵,任燕,张德锋,付小哲,林强,李宁求,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2015(05)
[5]基于荧光定量PCR的鳜传染性脾肾坏死病毒滴度检测方法[J]. 付小哲,李宁求,林强,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2014(09)
[6]鳜鱼传染性脾肾坏死病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立[J]. 安伟,肖雨,张崇文,张明辉,何正侃. 中国预防兽医学报. 2014(03)
[7]渔用疫苗发展现状及趋势[J]. 吴淑勤,陶家发,巩华,常藕琴,任燕,刘礼辉,陈总会,赖迎迢. 中国渔业质量与标准. 2014(01)
[8]鳜传染性脾肾坏死病毒ORF093基因的克隆、表达及其重组蛋白的免疫原性分析[J]. 付小哲,李宁求,彭媛媛,林强,石存斌,黄志斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2013(02)
[9]动物疫苗中灭活剂与佐剂的种类及其作用[J]. 卫龙兴,王福泉. 现代农业科技. 2009(19)
[10]鳜传染性脾肾坏死病毒重组主衣壳蛋白免疫效果的初步验证[J]. 付小哲,李宁求,彭媛媛,石存斌,白俊杰,吴淑勤. 中国水产科学. 2009(03)
硕士论文
[1]鳜传染性脾肾坏死病毒灭活疫苗检验关键技术研究[D]. 张醴溪.华中农业大学 2017
本文编号：2933726
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