RNA干扰对大鲵蛙病毒（CGSRV）主要功能基因表达与增殖影响的研究
发布时间：2020-12-24 06:43
大鲵蛙病毒（Chinese giant salamander Ranavirus, CGSRV）属于虹彩病毒科、蛙病毒属,是近年来发现的一种严重危害养殖大鲵的新病原,其感染具有发病率与死亡率高的特点,给大鲵养殖业的健康发展造成了严重威胁,其防控技术已成为人们研究的热点。RNA干扰（RNA interference, RNAi）是利用小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA）作为序列特异性的触发器,与细胞内同源的mRNA互补配对后再由RNase III家族中能够特异性识别双链RNA的Dicer酶切断,引起生物细胞内同源基因发生降解而表现出该基因特异性沉默的现象,达到阻碍病毒基因顺利表达的目的,起到预防和治疗病毒感染的目的。RNA干扰是生物进化的结果,参与多种真核生物功能,包括病毒防御、基因组重排、染色质重组、干细胞的维持、脑的形态建成以及发育时序决定等。本研究通过化学合成的方法,合成CGSRV病毒主要衣壳蛋白基因（MCP）、甲基转移酶基因（MTase）、DNA多聚酶基因（DNA polymerase）特异的siRNA,把siRNA转染到鲤鱼上皮瘤细胞（Epi...
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
论文缩略词表
第一章 文献综述
1 蛙病毒概述
1.1 蛙病毒生物学特性
1.2 蛙病毒的复制周期
1.3 蛙病毒的主要功能基因
1.4 蛙病毒的感染特性
1.5 大鲵蛙病毒
2 RNA干扰（RNA interference,RNAi）
2.1 RNA干扰现象的发现
2.2 RNA干扰的作用机制
2.3 获得siRNA的方法
2.4 展望未来
3 研究目的与意义
第二章 siRNA对CGSRV病毒MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
1 实验材料
1.1 大鲵蛙病毒（CGSRV）悬液
1.2 细胞株
1.3 细胞培养基
1.4 溶液及试剂
1.5 主要仪器
2 方法
2.1 siRNA靶序列的设计与合成
2.2 EPC细胞的传代培养
2.3 siRNA转染浓度的优化
2.4 最适病毒浓度的优化
2.5 siRNA对MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
3 结果与分析
3.1 siRNA靶序列的设计与合成
3.2 siRNA转染浓度的优化
3.3 最适病毒浓度的优化
3.4 siRNA对MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
4 讨论
4.1 siRNA的设计与合成
4.2 siRNA转染影响因素
4.3 siRNA的干扰
5 小结
第三章 荧光定量PCR法和病毒滴度（TCIDso）法检测siRNA的干扰效果
1 实验材料
1.1 CGSRV病毒悬液
1.2 实验试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂配制方法
2 方法
2.1 荧光定量PCR（qRT-PCR）引物设计与合成
2.2 总RNA提取
2.3 RNA纯度及浓度检测
2.4 RNA反转录（RT-PCR）
2.5 退火温度的优化与标准曲线的建立
2.6 MCP、MTases、DNA polymerase基因表达量的检测
50)测定"> 2.7 病毒滴度(TCID50)测定
3 结果与分析
3.1 RNA纯度和浓度检测
3.2 退火温度的优化
3.3 标准曲线及扩增效率
3.4 RNA干扰后各基因在不同时间点的相对表达
50)测定"> 3.5 病毒滴度(TCID50)测定
4 讨论
5 小结
结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表及参与发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]PCR引物设计方法综述[J]. 尤超,赵大球,梁乘榜,周春华. 现代农业科技. 2011(17)
[2]患病中国大鲵中分离到一株虹彩病毒及其特性的研究[J]. 江育林,张旻,景宏丽,高隆英. 病毒学报. 2011(03)
[3]慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元黏着斑激酶表达siRNA的筛选[J]. 张金平,唐荣华,吴军,刘红星,焦莉,许峰,康慧聪,朱遂强,薛峥. 华中科技大学学报(医学版). 2011(01)
[4]蛙病毒感染致养殖大鲵大规模死亡的电镜观察及PCR检测[J]. 耿毅,汪开毓,李成伟,王均,廖雨婷,黄锦炉,周赵英. 中国兽医科学. 2010(08)
[5]miRNA在肝细胞癌中的研究进展[J]. 戚鹏,高春芳. 中国生物工程杂志. 2008(12)
[6]蛙虹彩病毒一个晚期基因的鉴定[J]. 徐维,赵哲,张奇亚. 武汉大学学报(理学版). 2007(06)
[7]RNA干扰的实验方法及应用[J]. 吴丹,章丽娜,石娇,高志峰,谭克,刘雷,胡兰. 畜牧与兽医. 2007(07)
[8]沉默基因“闪亮”2006年诺贝尔医学奖[J]. 饶新华. 世界科学. 2006(11)
[9]RNA干扰与抗病毒感染[J]. 曹明媚,戚中田. 微生物学杂志. 2005(05)
[10]小鼠植入前胚胎对输卵管上皮细胞DNA甲基转移酶1表达的影响(英文)[J]. 黄琼晓,徐晨明,金帆,黄荷凤,钱羽力. 中华医学遗传学杂志. 2005(04)
博士论文
[1]蛙虹彩病毒（RGV）的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化[D]. 黄晓红.中国科学院研究生院（水生生物研究所） 2006
硕士论文
[1]大鲵蛙病毒生物学特性及其感染的病理学研究[D]. 周赵英.四川农业大学 2013
本文编号：2935185
【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
中文摘要
ABSTRACT
论文缩略词表
第一章 文献综述
1 蛙病毒概述
1.1 蛙病毒生物学特性
1.2 蛙病毒的复制周期
1.3 蛙病毒的主要功能基因
1.4 蛙病毒的感染特性
1.5 大鲵蛙病毒
2 RNA干扰（RNA interference,RNAi）
2.1 RNA干扰现象的发现
2.2 RNA干扰的作用机制
2.3 获得siRNA的方法
2.4 展望未来
3 研究目的与意义
第二章 siRNA对CGSRV病毒MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
1 实验材料
1.1 大鲵蛙病毒（CGSRV）悬液
1.2 细胞株
1.3 细胞培养基
1.4 溶液及试剂
1.5 主要仪器
2 方法
2.1 siRNA靶序列的设计与合成
2.2 EPC细胞的传代培养
2.3 siRNA转染浓度的优化
2.4 最适病毒浓度的优化
2.5 siRNA对MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
3 结果与分析
3.1 siRNA靶序列的设计与合成
3.2 siRNA转染浓度的优化
3.3 最适病毒浓度的优化
3.4 siRNA对MCP、MTases、DNA polymerase基因的干扰
4 讨论
4.1 siRNA的设计与合成
4.2 siRNA转染影响因素
4.3 siRNA的干扰
5 小结
第三章 荧光定量PCR法和病毒滴度（TCIDso）法检测siRNA的干扰效果
1 实验材料
1.1 CGSRV病毒悬液
1.2 实验试剂
1.3 主要仪器
1.4 主要试剂配制方法
2 方法
2.1 荧光定量PCR（qRT-PCR）引物设计与合成
2.2 总RNA提取
2.3 RNA纯度及浓度检测
2.4 RNA反转录（RT-PCR）
2.5 退火温度的优化与标准曲线的建立
2.6 MCP、MTases、DNA polymerase基因表达量的检测
50)测定"> 2.7 病毒滴度(TCID50)测定
3 结果与分析
3.1 RNA纯度和浓度检测
3.2 退火温度的优化
3.3 标准曲线及扩增效率
3.4 RNA干扰后各基因在不同时间点的相对表达
50)测定"> 3.5 病毒滴度(TCID50)测定
4 讨论
5 小结
结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位期间发表及参与发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]PCR引物设计方法综述[J]. 尤超,赵大球,梁乘榜,周春华. 现代农业科技. 2011(17)
[2]患病中国大鲵中分离到一株虹彩病毒及其特性的研究[J]. 江育林,张旻,景宏丽,高隆英. 病毒学报. 2011(03)
[3]慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元黏着斑激酶表达siRNA的筛选[J]. 张金平,唐荣华,吴军,刘红星,焦莉,许峰,康慧聪,朱遂强,薛峥. 华中科技大学学报(医学版). 2011(01)
[4]蛙病毒感染致养殖大鲵大规模死亡的电镜观察及PCR检测[J]. 耿毅,汪开毓,李成伟,王均,廖雨婷,黄锦炉,周赵英. 中国兽医科学. 2010(08)
[5]miRNA在肝细胞癌中的研究进展[J]. 戚鹏,高春芳. 中国生物工程杂志. 2008(12)
[6]蛙虹彩病毒一个晚期基因的鉴定[J]. 徐维,赵哲,张奇亚. 武汉大学学报(理学版). 2007(06)
[7]RNA干扰的实验方法及应用[J]. 吴丹,章丽娜,石娇,高志峰,谭克,刘雷,胡兰. 畜牧与兽医. 2007(07)
[8]沉默基因“闪亮”2006年诺贝尔医学奖[J]. 饶新华. 世界科学. 2006(11)
[9]RNA干扰与抗病毒感染[J]. 曹明媚,戚中田. 微生物学杂志. 2005(05)
[10]小鼠植入前胚胎对输卵管上皮细胞DNA甲基转移酶1表达的影响(英文)[J]. 黄琼晓,徐晨明,金帆,黄荷凤,钱羽力. 中华医学遗传学杂志. 2005(04)
博士论文
[1]蛙虹彩病毒（RGV）的复制与宿主细胞骨架及超微组织变化[D]. 黄晓红.中国科学院研究生院（水生生物研究所） 2006
硕士论文
[1]大鲵蛙病毒生物学特性及其感染的病理学研究[D]. 周赵英.四川农业大学 2013
本文编号：2935185
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