噬菌体防控苗期刺参弧菌感染的研究
发布时间：2020-12-27 00:03
刺参（Apostichopus japonicus）具有极高的经济价值,是中国北方重要的经济类水产养殖动物之一。刺参细菌性疾病是困扰刺参养殖业的主要问题,病原弧菌是其主要的致病菌。为消除病原菌威胁,大量的抗生素和化学类药物被投入使用,最终导致水环境污染,菌群微生态失衡,抗生素残留,细菌耐药性产生,制约了刺参养殖业的可持续发展,因此亟需一种新型的抑菌方式以替代抗生素。到目前为止,国际研究领域的主流替代方式是采用噬菌体疗法,关于噬菌体应用的研究已经成为热点,涉及诸多领域,如农业、畜牧业、食品安全保障行业等。鉴于此,本课题将噬菌体的应用策略引入到苗期刺参养殖领域,探索噬菌体疗法在该领域应用的有效性与安全性。本课题的主要研究内容和结果总结如下:（1）筛选获得引发苗期刺参感染的病原弧菌两株,分离得到相应病原菌的噬菌体,并对其进行了必要的理化性质分析。经透射电镜观察、生理生化实验和分子生物学实验鉴定两株病原弧菌为嗜环弧菌和灿烂弧菌,分别命名为嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL。采用人工攻毒处理方式,测定了两株优势病原弧菌的半数致死量,嗜环弧菌VC1的半数致死量LD50值为8.75 × 105...
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：174 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 绪论
1.1 刺参与刺参养殖业现状
1.1.1 刺参的生物学特征及其营养价值
1.1.2 刺参经济产业的发展与瓶颈分析
1.1.3 弧菌病与刺参腐皮综合征
1.1.4 刺参非特异性免疫
1.2 噬菌体简介
1.2.1 噬菌体重要里程碑式事件
1.2.2 噬菌体分类与生物学特性
1.2.3 弧菌噬菌体基因组研究
1.3 噬菌体防控主要水产养殖类致病菌
1.3.1 水产养殖业抗生素替代的必要性分析
1.3.2 噬菌体防控水产养殖类致病菌
1.3.3 噬菌体在水产养殖业中应用前景
1.3.4 噬菌体保藏
1.4 论文研究目的及内容
2 致病弧菌及其噬菌体的分离纯化与理化性质
2.1 引言
2.2 实验材料和设备
2.2.1 实验动物
2.2.2 实验条件
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要仪器设备
2.2.5 引物合成
2.2.6 溶液配制
2.3 实验方法
2.3.1 病原菌的分离纯化
2.3.2 病原菌生理生化指标测定
2.3.3 病原菌形态学鉴定
2.3.4 病原菌分子生物学鉴定
2.3.5 病原菌的药敏分析
2.3.6 病原菌致病能力检测
2.3.7 宿主菌的非溶源性检测
2.3.8 裂解性噬菌体筛选分离纯化
2.3.9 噬菌体的扩增与浓缩
2.3.10 噬菌体效价测定
2.3.11 噬菌体形态学观察
2.3.12 噬菌体氯仿敏感性测试
2.3.13 噬菌体宿主谱测定
2.3.14 噬菌体吸附速率测定
2.3.15 噬菌体一步生长曲线测定
2.3.16 噬菌体的体外抑菌效率测定
2.4 实验结果
2.4.1 患病刺参的症状与病原菌菌落形态
2.4.2 两株病原菌的透射电镜观察
2.4.3 两株病原菌的生理生化指标
2.4.4 两株病原菌的亲缘关系确定
2.4.5 两株病原菌的药物敏感性
50)"> 2.4.6 两株病原菌的半数致死量与半数致死浓度(LD50)
2.4.7 病原菌的非溶源性确定
2.4.8 噬菌体的噬菌斑形态
2.4.9 噬菌体透射电镜形态
2.4.10 噬菌体对氯仿的敏感性
2.4.11 噬菌体的宿主谱范围
2.4.12 噬菌体的吸附速率
2.4.13 噬菌体的一步生长曲线
2.4.14 噬菌体的体外抑菌效果
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组测序与注释
3.1 引言
3.2 实验材料和主要仪器设备
3.2.1 实验菌株与噬菌体
3.2.2 主要试剂
3.2.3 仪器设备
3.2.4 溶液配制
3.3 实验方法
3.3.1 vibrio phage Vc1和PVS3噬菌体颗粒的纯化与浓缩
3.3.2 CsCl等密度梯度离心及回收
3.3.3 两株噬菌体的全基因组DNA提取
3.3.4 DNA浓度与电泳纯度分析
3.3.5 两株噬菌体的全基因组测序
3.3.6 两株噬菌体基本生物信息学分析
3.3.7 两株噬菌体全基因组基因功能预测和蛋白图谱注释
3.3.8 噬菌体的主要功能基因比对与进化分析
3.4 实验结果
3.4.1 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组DNA检测
3.4.2 高通量测序分析数据质检
3.4.3 高通量测序分析基因含量预测
3.4.4 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的基因分布结果
3.4.5 噬菌体vibrio phageVc1和PVS3的开放阅读框预测
3.4.6 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的Go数据库分析
3.4.7 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3基因组的功能基因确定
3.4.8 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3全基因组蛋白图谱
3.4.9 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的分类地位
3.4.10 噬菌体胞壁水解酶一级与二级蛋白结构
3.5 讨论
3.6 本章小结
4 噬菌体应用剂型的制备及其防控效果评价
4.1 引言
4.2 实验材料和设备
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验用细菌菌株和噬菌体
4.2.3 主要试剂
4.2.4 仪器设备
4.2.5 饲料原料
4.2.6 试剂配制
4.3 实验方法
4.3.1 噬菌体针剂制备
4.3.2 噬菌体真空冷冻干燥处理最优保护剂选择
4.3.3 噬菌体浸浴制剂的制备
4.3.4 攻毒用嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL的制备
4.3.5 噬菌体针剂对刺参的攻毒治疗效果考察
4.3.6 饲喂噬菌体的饲料制备与基础成分分析
4.3.7 饲喂噬菌体添加剂对刺参的攻毒保护效果考察
4.3.8 混合噬菌体制剂对刺参的攻毒保护效果考察
4.3.9 刺参养殖水体和刺参肠道噬菌体效价测定
4.3.10 噬菌体注射针剂的温度与pH耐受性检测
4.3.11 不同噬菌体制剂的长期保藏效果考察
4.3.12 数据统计分析
4.4 实验结果
4.4.1 不同保护剂冻干处理对噬菌体效价的影响
4.4.2 不同保护剂处理的噬菌体冻干粉的溶解时间
4.4.3 不同噬菌体冻干处理组的含湿量测定结果
4.4.4 噬菌体注射治疗效果
4.4.5 新型饲料基础成分分析
4.4.6 嗜环弧菌噬菌体饲喂保护效果
4.4.7 灿烂弧菌噬菌体饲喂保护效果
4.4.8 浸浴混合噬菌体对刺参的保护效果
4.4.9 饲喂实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测
4.4.10 浸浴实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测
4.4.11 噬菌体注射针剂对温度与pH的耐受性分析
4.4.12 不同噬菌体制剂长期保藏效果比对
4.5 讨论
4.6 本章小结
5 施用噬菌体对刺参主要生理指标的影响
5.1 引言
5.2 实验材料与设备
5.2.1 实验动物及菌种、噬菌体
5.2.2 主要试剂
5.2.3 主要仪器设备
5.2.4 试剂配制
5.3 实验方法
5.3.1 高纯度噬菌体颗粒制备
5.3.2 刺参体腔细胞的提取与原代培养
5.3.3 噬菌体颗粒与刺参体腔细胞共培养
5.3.4 噬菌体对刺参吞噬活性影响的考察
5.3.5 噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察
5.3.6 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察
5.3.7 苗期刺参体腔液样本酶活的测定
5.3.8 考察饲喂噬菌体对刺参生产状态影响
5.3.9 刺参肠道菌群高通量分析样品准备
5.3.10 生物菌群结构多样性分析
5.3.11 数据统计分析
5.4 结果
5.4.1 刺参体腔细胞体外培养相对活性检测
5.4.2 体外共培养噬菌体对刺参体腔细胞的影响
5.4.3 噬菌体共培养对刺参吞噬细胞吞噬活性的影响
5.4.4 注射噬菌体对刺参主要非特异免疫酶活的影响
5.4.5 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活的影响
5.4.6 饲喂噬菌体对刺参生长状态的影响
5.4.7 饲喂噬菌体对刺参肠道菌群结构的影响
5.5 讨论
5.6 本章小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录A 嗜环弧菌vibrio phage Vcl ORF在线预测结果
VspSVS-ABTNL-3（PVS3）ORF在线预测结果">附录B 灿烂弧菌vBVspSVS-ABTNL-3（PVS3）ORF在线预测结果
作者简介
攻读博士学位期间科研项目及科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]噬菌体治疗的前世、今生与未来——对话微生物学界噬菌体专家[J]. 安瑞. 科学通报. 2017(23)
[2]刺参营养价值研究进展[J]. 张新明,王君政. 养殖与饲料. 2017(06)
[3]我国刺参产业发展状况、趋势与对策建议[J]. 李成林,胡炜. 中国海洋经济. 2017(01)
[4]辽宁海参养殖业形势分析(下)[J]. 吴杨镝. 科学养鱼. 2016(12)
[5]3株木糖氧化无色杆菌烈性噬菌体的最佳保存方法研究[J]. 黎尔纳,马艳艳,程伟伟,蒋爱民,袁静,赵向娜. 军事医学. 2016(10)
[6]10种海参营养成分分析[J]. 赵玲,马红伟,曹荣,刘淇. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[7]水产养殖环境中抗生素抗性基因污染及其研究进展[J]. 张骞月,赵婉婉,吴伟. 中国农业科技导报. 2015(06)
[8]海参池塘养殖中的常见疾病[J]. 李景胜,周井祥,金晔. 科学养鱼. 2015(09)
[9]噬菌体控制主要水产养殖类致病菌的研究进展[J]. 李振,张建城,曹振辉,王熙涛,王丽丽,李晓宇,徐永平,李淑英. 畜牧与兽医. 2015(08)
[10]噬菌体控制细菌性疾病的施用途径研究[J]. 曹振辉,胡大勇,张建城,李振,彭亮,王丽丽,徐永平,李淑英. 畜牧与兽医. 2015(02)
博士论文
[1]分枝杆菌噬菌体的生物学特性及基因组学研究[D]. 刘平.重庆医科大学 2012
[2]口服微囊化噬菌体的制备及其在胃肠环境中的稳定性、释放行为和抗菌活性研究[D]. 马永生.大连理工大学 2011
硕士论文
[1]鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定及其初步应用[D]. 袁玉玉.吉林大学 2016
[2]铜绿假单胞菌裂解性噬菌体YH6的分离鉴定及其生物学特性研究[D]. 杨梅.吉林大学 2015
[3]副溶血弧菌噬菌体VPp1在牡蛎净化中的应用及其规模化制备和保存[D]. 荣蓉.中国海洋大学 2014
[4]应用噬菌体防治弧菌引发的刺参腐皮综合征[D]. 杨扬.大连理工大学 2013
[5]副溶血弧菌噬菌体qdvp001的分离鉴定及其在牡蛎净化中的初步应用[D]. 丁云娟.中国海洋大学 2012
[6]养殖刺参腐皮综合症病灶处七株优势菌生理生化特性及其群体感应信号分子活性检测[D]. 苏明霞.中国海洋大学 2008
本文编号：2940697
【文章来源】：大连理工大学辽宁省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：174 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
1 绪论
1.1 刺参与刺参养殖业现状
1.1.1 刺参的生物学特征及其营养价值
1.1.2 刺参经济产业的发展与瓶颈分析
1.1.3 弧菌病与刺参腐皮综合征
1.1.4 刺参非特异性免疫
1.2 噬菌体简介
1.2.1 噬菌体重要里程碑式事件
1.2.2 噬菌体分类与生物学特性
1.2.3 弧菌噬菌体基因组研究
1.3 噬菌体防控主要水产养殖类致病菌
1.3.1 水产养殖业抗生素替代的必要性分析
1.3.2 噬菌体防控水产养殖类致病菌
1.3.3 噬菌体在水产养殖业中应用前景
1.3.4 噬菌体保藏
1.4 论文研究目的及内容
2 致病弧菌及其噬菌体的分离纯化与理化性质
2.1 引言
2.2 实验材料和设备
2.2.1 实验动物
2.2.2 实验条件
2.2.3 主要试剂
2.2.4 主要仪器设备
2.2.5 引物合成
2.2.6 溶液配制
2.3 实验方法
2.3.1 病原菌的分离纯化
2.3.2 病原菌生理生化指标测定
2.3.3 病原菌形态学鉴定
2.3.4 病原菌分子生物学鉴定
2.3.5 病原菌的药敏分析
2.3.6 病原菌致病能力检测
2.3.7 宿主菌的非溶源性检测
2.3.8 裂解性噬菌体筛选分离纯化
2.3.9 噬菌体的扩增与浓缩
2.3.10 噬菌体效价测定
2.3.11 噬菌体形态学观察
2.3.12 噬菌体氯仿敏感性测试
2.3.13 噬菌体宿主谱测定
2.3.14 噬菌体吸附速率测定
2.3.15 噬菌体一步生长曲线测定
2.3.16 噬菌体的体外抑菌效率测定
2.4 实验结果
2.4.1 患病刺参的症状与病原菌菌落形态
2.4.2 两株病原菌的透射电镜观察
2.4.3 两株病原菌的生理生化指标
2.4.4 两株病原菌的亲缘关系确定
2.4.5 两株病原菌的药物敏感性
50)"> 2.4.6 两株病原菌的半数致死量与半数致死浓度(LD50)
2.4.7 病原菌的非溶源性确定
2.4.8 噬菌体的噬菌斑形态
2.4.9 噬菌体透射电镜形态
2.4.10 噬菌体对氯仿的敏感性
2.4.11 噬菌体的宿主谱范围
2.4.12 噬菌体的吸附速率
2.4.13 噬菌体的一步生长曲线
2.4.14 噬菌体的体外抑菌效果
2.5 讨论
2.6 本章小结
3 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组测序与注释
3.1 引言
3.2 实验材料和主要仪器设备
3.2.1 实验菌株与噬菌体
3.2.2 主要试剂
3.2.3 仪器设备
3.2.4 溶液配制
3.3 实验方法
3.3.1 vibrio phage Vc1和PVS3噬菌体颗粒的纯化与浓缩
3.3.2 CsCl等密度梯度离心及回收
3.3.3 两株噬菌体的全基因组DNA提取
3.3.4 DNA浓度与电泳纯度分析
3.3.5 两株噬菌体的全基因组测序
3.3.6 两株噬菌体基本生物信息学分析
3.3.7 两株噬菌体全基因组基因功能预测和蛋白图谱注释
3.3.8 噬菌体的主要功能基因比对与进化分析
3.4 实验结果
3.4.1 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的全基因组DNA检测
3.4.2 高通量测序分析数据质检
3.4.3 高通量测序分析基因含量预测
3.4.4 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的基因分布结果
3.4.5 噬菌体vibrio phageVc1和PVS3的开放阅读框预测
3.4.6 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的Go数据库分析
3.4.7 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3基因组的功能基因确定
3.4.8 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3全基因组蛋白图谱
3.4.9 噬菌体vibrio phage Vc1和PVS3的分类地位
3.4.10 噬菌体胞壁水解酶一级与二级蛋白结构
3.5 讨论
3.6 本章小结
4 噬菌体应用剂型的制备及其防控效果评价
4.1 引言
4.2 实验材料和设备
4.2.1 实验动物
4.2.2 实验用细菌菌株和噬菌体
4.2.3 主要试剂
4.2.4 仪器设备
4.2.5 饲料原料
4.2.6 试剂配制
4.3 实验方法
4.3.1 噬菌体针剂制备
4.3.2 噬菌体真空冷冻干燥处理最优保护剂选择
4.3.3 噬菌体浸浴制剂的制备
4.3.4 攻毒用嗜环弧菌VC1和灿烂弧菌VS-ABTNL的制备
4.3.5 噬菌体针剂对刺参的攻毒治疗效果考察
4.3.6 饲喂噬菌体的饲料制备与基础成分分析
4.3.7 饲喂噬菌体添加剂对刺参的攻毒保护效果考察
4.3.8 混合噬菌体制剂对刺参的攻毒保护效果考察
4.3.9 刺参养殖水体和刺参肠道噬菌体效价测定
4.3.10 噬菌体注射针剂的温度与pH耐受性检测
4.3.11 不同噬菌体制剂的长期保藏效果考察
4.3.12 数据统计分析
4.4 实验结果
4.4.1 不同保护剂冻干处理对噬菌体效价的影响
4.4.2 不同保护剂处理的噬菌体冻干粉的溶解时间
4.4.3 不同噬菌体冻干处理组的含湿量测定结果
4.4.4 噬菌体注射治疗效果
4.4.5 新型饲料基础成分分析
4.4.6 嗜环弧菌噬菌体饲喂保护效果
4.4.7 灿烂弧菌噬菌体饲喂保护效果
4.4.8 浸浴混合噬菌体对刺参的保护效果
4.4.9 饲喂实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测
4.4.10 浸浴实验中刺参养殖水体和肠道的噬菌体效价检测
4.4.11 噬菌体注射针剂对温度与pH的耐受性分析
4.4.12 不同噬菌体制剂长期保藏效果比对
4.5 讨论
4.6 本章小结
5 施用噬菌体对刺参主要生理指标的影响
5.1 引言
5.2 实验材料与设备
5.2.1 实验动物及菌种、噬菌体
5.2.2 主要试剂
5.2.3 主要仪器设备
5.2.4 试剂配制
5.3 实验方法
5.3.1 高纯度噬菌体颗粒制备
5.3.2 刺参体腔细胞的提取与原代培养
5.3.3 噬菌体颗粒与刺参体腔细胞共培养
5.3.4 噬菌体对刺参吞噬活性影响的考察
5.3.5 噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察
5.3.6 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活影响的考察
5.3.7 苗期刺参体腔液样本酶活的测定
5.3.8 考察饲喂噬菌体对刺参生产状态影响
5.3.9 刺参肠道菌群高通量分析样品准备
5.3.10 生物菌群结构多样性分析
5.3.11 数据统计分析
5.4 结果
5.4.1 刺参体腔细胞体外培养相对活性检测
5.4.2 体外共培养噬菌体对刺参体腔细胞的影响
5.4.3 噬菌体共培养对刺参吞噬细胞吞噬活性的影响
5.4.4 注射噬菌体对刺参主要非特异免疫酶活的影响
5.4.5 饲喂噬菌体对刺参非特异免疫酶活的影响
5.4.6 饲喂噬菌体对刺参生长状态的影响
5.4.7 饲喂噬菌体对刺参肠道菌群结构的影响
5.5 讨论
5.6 本章小结
6 结论与展望
6.1 结论
6.2 创新点
6.3 展望
参考文献
附录A 嗜环弧菌vibrio phage Vcl ORF在线预测结果
VspSVS-ABTNL-3（PVS3）ORF在线预测结果">附录B 灿烂弧菌vBVspSVS-ABTNL-3（PVS3）ORF在线预测结果
作者简介
攻读博士学位期间科研项目及科研成果
致谢
【参考文献】：
期刊论文
[1]噬菌体治疗的前世、今生与未来——对话微生物学界噬菌体专家[J]. 安瑞. 科学通报. 2017(23)
[2]刺参营养价值研究进展[J]. 张新明,王君政. 养殖与饲料. 2017(06)
[3]我国刺参产业发展状况、趋势与对策建议[J]. 李成林,胡炜. 中国海洋经济. 2017(01)
[4]辽宁海参养殖业形势分析(下)[J]. 吴杨镝. 科学养鱼. 2016(12)
[5]3株木糖氧化无色杆菌烈性噬菌体的最佳保存方法研究[J]. 黎尔纳,马艳艳,程伟伟,蒋爱民,袁静,赵向娜. 军事医学. 2016(10)
[6]10种海参营养成分分析[J]. 赵玲,马红伟,曹荣,刘淇. 食品安全质量检测学报. 2016(07)
[7]水产养殖环境中抗生素抗性基因污染及其研究进展[J]. 张骞月,赵婉婉,吴伟. 中国农业科技导报. 2015(06)
[8]海参池塘养殖中的常见疾病[J]. 李景胜,周井祥,金晔. 科学养鱼. 2015(09)
[9]噬菌体控制主要水产养殖类致病菌的研究进展[J]. 李振,张建城,曹振辉,王熙涛,王丽丽,李晓宇,徐永平,李淑英. 畜牧与兽医. 2015(08)
[10]噬菌体控制细菌性疾病的施用途径研究[J]. 曹振辉,胡大勇,张建城,李振,彭亮,王丽丽,徐永平,李淑英. 畜牧与兽医. 2015(02)
博士论文
[1]分枝杆菌噬菌体的生物学特性及基因组学研究[D]. 刘平.重庆医科大学 2012
[2]口服微囊化噬菌体的制备及其在胃肠环境中的稳定性、释放行为和抗菌活性研究[D]. 马永生.大连理工大学 2011
硕士论文
[1]鸡白痢沙门菌噬菌体的分离鉴定及其初步应用[D]. 袁玉玉.吉林大学 2016
[2]铜绿假单胞菌裂解性噬菌体YH6的分离鉴定及其生物学特性研究[D]. 杨梅.吉林大学 2015
[3]副溶血弧菌噬菌体VPp1在牡蛎净化中的应用及其规模化制备和保存[D]. 荣蓉.中国海洋大学 2014
[4]应用噬菌体防治弧菌引发的刺参腐皮综合征[D]. 杨扬.大连理工大学 2013
[5]副溶血弧菌噬菌体qdvp001的分离鉴定及其在牡蛎净化中的初步应用[D]. 丁云娟.中国海洋大学 2012
[6]养殖刺参腐皮综合症病灶处七株优势菌生理生化特性及其群体感应信号分子活性检测[D]. 苏明霞.中国海洋大学 2008
本文编号：2940697
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