淇河鲫c型和g型溶菌酶基因克隆及表达分析
发布时间：2021-01-06 11:19
淇河鲫（Qihe crucian carp Carassius auratus）,具有很高的营养和经济价值。近年来,高密度、集约化的养殖模式,导致鱼类疾病暴发。因此,提高免疫能力对控制鱼类疾病的发生显得尤为重要。溶菌酶（Lysozyme,Lys）是一种重要的非特异性免疫因子,它通过水解细菌细胞壁的β-1,4糖苷键而杀死细菌,对鱼类抵御外界细菌入侵具有重要作用。本研究以河南鹤壁水产养殖场的淇河鲫为研究对象,以肝脏总RNA为模板,使用RT-PCR和RACE技术克隆淇河鲫c型和g型溶菌酶c DNA全长;采用荧光定量PCR法和比浊法对淇河鲫不同组织溶菌酶的表达及酶活性进行测定;同时对经嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）和脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）处理后,各组织溶菌酶表达变化及酶活性进行分析,为研究淇河鲫溶菌酶的免疫防御功能及分子机制奠定理论基础。基因克隆获得c型溶菌酶c DNA全长为679 bp,开放阅读框为438 bp,编码145个氨基酸。理论等电点为8.86,相对分子质量为1.66 ku。含有两个保守的氨基酸催化位点,分别是Glu（第53位...
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 前言
1.1 鱼类非特异性免疫
1.1.1 非特异性免疫细胞
1.1.2 非特异性免疫因子
1.2 溶菌酶的研究进展
1.2.1 溶菌酶的发现
1.2.2 溶菌酶的分类
1.2.3 溶菌酶的结构
1.2.4 溶菌酶的生物学特性
1.2.5 溶菌酶测定方法
1.3 鱼类溶菌酶研究
1.3.1 鱼类溶菌酶种类分布
1.3.2 鱼类溶菌酶结构特征
1.3.3 鱼类溶菌酶在组织中的表达及活性
1.3.4 应激条件下鱼类溶菌酶表达变化
1.3.5 鱼类溶菌酶重组蛋白表达及抗菌谱研究
1.4 溶菌酶的应用
1.4.1 溶菌酶在渔业生产上的应用
1.4.2 溶菌酶在疾病诊疗中的应用
1.4.3 溶菌酶在转基因工程中的应用
1.5 论文的研究背景、目的意义及技术路线
第二章 淇河鲫c型和g型溶菌酶基因克隆
2.1 实验材料
2.1.1 实验用鱼
2.1.2 实验试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 引物设计及合成
2.2.2 淇河鲫总RNA的提取
2.2.3 淇河鲫cDNA第一条链合成及中间片段扩增
2.2.4 淇河鲫c型和g型溶菌酶 3’RACE
2.2.5 淇河鲫c型和g型溶菌酶 5’RACE
2.2.6 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶回收
2.2.7 胶回收产物与T载体连接
2.2.8 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的转化
2.2.9 阳性克隆的检测
2.2.10 序列拼接及分析
2.3 实验结果
2.3.1 肝脏总RNA的提取
2.3.2 淇河鲫c型和g型溶菌酶中间片段克隆
2.3.3 淇河鲫c型和g型溶菌酶 3’端扩增
2.3.4 淇河鲫c型和g型溶菌酶 5’端扩增
2.3.5 序列拼接及分析
2.3.6 淇河鲫c型和g型溶菌酶高级结构分析
2.3.7 淇河鲫c型和g型溶菌酶同源性分析及进化树构建
2.4 讨论
第三章 嗜水气单胞菌和脂多糖处理后淇河鲫各组织溶菌酶基因表达量及酶活性变化
3.1 实验材料
3.1.1 实验试剂
3.1.2 淇河鲫驯养
3.1.3 嗜水气单胞菌的培养及侵染
3.2 实验方法
3.2.1 淇河鲫不同组织溶菌酶mRNA表达量
3.2.2 淇河鲫不同器官组织溶菌酶活性测定
3.2.3 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶基因表达的测定
3.2.4 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶活性的测定
3.3 实验结果
3.3.1 淇河鲫c型和g型溶菌酶在不同器官组织中的表达
3.3.2 淇河鲫不同器官组织溶菌酶活性
3.3.3 嗜水气单胞菌和LPS处理后c型和g型溶菌酶的表达变化
3.3.4 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶活性变化
3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：2960475
【文章来源】：河南师范大学河南省
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略词表
第一章 前言
1.1 鱼类非特异性免疫
1.1.1 非特异性免疫细胞
1.1.2 非特异性免疫因子
1.2 溶菌酶的研究进展
1.2.1 溶菌酶的发现
1.2.2 溶菌酶的分类
1.2.3 溶菌酶的结构
1.2.4 溶菌酶的生物学特性
1.2.5 溶菌酶测定方法
1.3 鱼类溶菌酶研究
1.3.1 鱼类溶菌酶种类分布
1.3.2 鱼类溶菌酶结构特征
1.3.3 鱼类溶菌酶在组织中的表达及活性
1.3.4 应激条件下鱼类溶菌酶表达变化
1.3.5 鱼类溶菌酶重组蛋白表达及抗菌谱研究
1.4 溶菌酶的应用
1.4.1 溶菌酶在渔业生产上的应用
1.4.2 溶菌酶在疾病诊疗中的应用
1.4.3 溶菌酶在转基因工程中的应用
1.5 论文的研究背景、目的意义及技术路线
第二章 淇河鲫c型和g型溶菌酶基因克隆
2.1 实验材料
2.1.1 实验用鱼
2.1.2 实验试剂
2.1.3 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 引物设计及合成
2.2.2 淇河鲫总RNA的提取
2.2.3 淇河鲫cDNA第一条链合成及中间片段扩增
2.2.4 淇河鲫c型和g型溶菌酶 3’RACE
2.2.5 淇河鲫c型和g型溶菌酶 5’RACE
2.2.6 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶回收
2.2.7 胶回收产物与T载体连接
2.2.8 大肠杆菌DH5α 感受态细胞的转化
2.2.9 阳性克隆的检测
2.2.10 序列拼接及分析
2.3 实验结果
2.3.1 肝脏总RNA的提取
2.3.2 淇河鲫c型和g型溶菌酶中间片段克隆
2.3.3 淇河鲫c型和g型溶菌酶 3’端扩增
2.3.4 淇河鲫c型和g型溶菌酶 5’端扩增
2.3.5 序列拼接及分析
2.3.6 淇河鲫c型和g型溶菌酶高级结构分析
2.3.7 淇河鲫c型和g型溶菌酶同源性分析及进化树构建
2.4 讨论
第三章 嗜水气单胞菌和脂多糖处理后淇河鲫各组织溶菌酶基因表达量及酶活性变化
3.1 实验材料
3.1.1 实验试剂
3.1.2 淇河鲫驯养
3.1.3 嗜水气单胞菌的培养及侵染
3.2 实验方法
3.2.1 淇河鲫不同组织溶菌酶mRNA表达量
3.2.2 淇河鲫不同器官组织溶菌酶活性测定
3.2.3 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶基因表达的测定
3.2.4 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶活性的测定
3.3 实验结果
3.3.1 淇河鲫c型和g型溶菌酶在不同器官组织中的表达
3.3.2 淇河鲫不同器官组织溶菌酶活性
3.3.3 嗜水气单胞菌和LPS处理后c型和g型溶菌酶的表达变化
3.3.4 嗜水气单胞菌和LPS处理后溶菌酶活性变化
3.4 讨论
第四章 结论
参考文献
附录
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
本文编号：2960475
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