溶藻弧菌野生株和突变株ΔtssJ的差异表达序列分析及其TssJ多抗制备

发布时间：2021-02-01 22:58

　　溶藻弧菌（Vibrio alginolyticus）是水产病害中最常见的细菌病原之一,可以感染鱼、虾、贝等多种水生动物,对海水养殖业造成了巨大的经济损失。新近的研究表明,Ⅵ型分泌系统（T6SS）在溶藻弧菌生物膜形成、鞭毛合成和细胞毒力等致病相关功能中可能发挥了重要作用,共包括TssJ、TssM和TssL等13个核心亚基。其中,TssJ是一个通过N末端酰基化的半胱氨酸残基锚定在外膜上的外膜脂蛋白,并证实在大肠杆菌的T6SS组装中扮演了非常重要的角色,迄今未见关于溶藻弧菌tssJ的功能研究。溶藻弧菌HN08155为本实验室保存的海水养殖动物病原菌株,本文拟采用转录组测定及生物信息学分析,确定HN08155及其突变株△tssJ的基因差异表达情况,并制备TssJ的多克隆抗体,为阐明溶藻弧菌tssJ的功能奠定基础。本实验利用RNA-Seq技术对溶藻弧菌野生株HN08155及其突变株△tssJ的生物膜形成初期的转录组进行研究。经过拼接与注释共获得3600条Unigene。对两菌株的基因表达量分析,共获得180个基因差异表达,其中84个基因的表达量上调,96个基因的表达量下调。这些差异表达基因主要包... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：54 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
中文摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 溶藻弧菌
    2 T6SS与TssJ蛋白
    3 转录组及其研究方法
        3.1 转录组
        3.2 转录组研究方法
            3.2.1 基因芯片
            3.2.2 表达序列标签（EST）技术
            3.2.3 RNA-Seq技术
    4 原核表达载体
    5 研究目的及意义
    6 技术路线
        6.1 溶藻弧菌转录组测序技术路线图
        6.2 tssJ原核表达及多克隆抗体制备技术路线
第二章 溶藻弧菌野生株和突变株△tssJ的差异表达序列分析
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 菌株
        2.2 主要试剂材料及仪器
            2.2.1 主要试剂材料
            2.2.2 主要仪器
    3 实验方法
        3.1 提取RNA时间确定
        3.2 总RNA的提取
        3.3 RNA文库构建
        3.4 文库质量控制
        3.5 转录组测序
        3.6 转录组分析
        3.7 荧光定量PCR（RT-PCR）
    4 结果与分析
        4.1 总RNA浓度测定及质控检测
        4.2 测序数据产出统计
        4.3 数据组装结果
            4.3.1 组装结果统计
            4.3.2 测序结果与组装结果的比对统计
        4.4 差异表达分析
            4.4.1 差异表达基因筛选
        4.5 差异表达基因功能注释和富集分析
            4.5.1 差异表达基因GO功能富集
            4.5.2 差异表达基因COG分类
            4.5.3 差异基因的KEGG富集分析
        4.6 RT-PCR结果
    5 讨论
第三章 溶藻弧菌tssJ基因原核表达及多克隆抗体制备
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 菌株、质粒及培养条件
        2.2 实验动物
        2.3 主要试剂材料及仪器
            2.3.1 主要试剂材料
            2.3.2 主要仪器
        2.4 常用溶液配制
    3 实验方法
        3.1 tssJ基因的获得
            3.1.1 WT基因组DNA提取
            3.1.2 目的片段扩增
            3.1.3 感受态细胞制备
            3.1.4 溶藻弧菌tssJ基因与T载体连接
            3.1.5 T-tssJ的转化
            3.1.6 重组质粒的筛选与鉴定
        3.2 表达重组质粒构建及鉴定
            3.2.1 pET32a质粒处理
            3.2.2 表达载体构建及转化
            3.2.3 重组质粒筛选与鉴定
        3.3 tssJ基因的诱导表达
        3.4 SDS-PAGE分析
        3.5 tssJ基因表达产物大量表达及纯化
            3.5.1 tssJ基因表达产物大量表达
            3.5.2 目的蛋白纯化
        3.6 多克隆抗体制备
        3.7 抗体效价测定
    4 结果
        4.1 tssJ基因的扩增
        4.2 表达载体构建与检测
        4.3 tssJ基因表达产物SDS-PAGE电泳分析
        4.4 tssJ基因表达产物的纯化
        4.5 抗体效价的检测
    5 讨论
第四章 结论
中英文缩略词表
参考文献
作者在读期间发表论文情况
致谢


【参考文献】：
期刊论文
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[2]猪STAT-1α基因的原核表达及其多克隆抗体制备[J]. 李延生,刘诚,张珂,李晓宁,李晓泉,尹珊,谢琳娟,何晓霞,罗扬,钟桃珍,罗廷荣.  南方农业学报. 2014(01)
[3]转录组研究新技术:RNA-Seq及其应用[J]. 祁云霞,刘永斌,荣威恒.  遗传. 2011(11)
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[6]鞭毛介导的运动性与细菌生物膜的相互关系[J]. 丁莉莎,王瑶.  微生物学报. 2009(04)
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博士论文
[1]两株鳗弧菌全基因组序列测定及转录组比较分析[D]. 李贵阳.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2011
[2]丹参道地药材cDNA芯片构建及毛状根基因表达谱研究[D]. 崔光红.中国中医科学院 2006

硕士论文
[1]南极海冰细菌Pseudoalteromonas sp.GST的克隆及酶学特性研究[D]. 洪艳艳.哈尔滨工业大学 2013
[2]溶藻弧菌毒力菌株基因缺失突变株的构建及表型初步分析[D]. 李宏.海南大学 2013
[3]大肠杆菌cysE和cysM基因的克隆、原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 方堃.西北农林科技大学 2011



本文编号：3013578