两种佐剂对虹鳟杀鲑气单胞菌灭活疫苗免疫效果的影响
发布时间：2021-02-19 03:28
杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida,As）是一类重要的咸淡水养殖动物病原菌,主要引起鲑鳟鱼类如虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、金鳟（Oncorhynchus mykiss）和大西洋鲑（Salmo salar）等疖疮病及溃疡病,被感染鱼体死亡率高影响范围广,并且其宿主范围在逐年扩大,严重制约了中国鲑鳟鱼养殖业健康发展。目前,中国一般采用化学药物及各类抗生素防治杀鲑气单胞菌,抗生素药物的使用容易导致病原菌出现交叉耐药反应,同时也使人类面临环境污染及食品安全问题。疫苗是防治杀鲑气单胞菌的最有效方法,在国外,采用接种商业化疫苗方法预防此菌感染已取得较好的保护效果。因而针对虹鳟杀鲑气单胞菌开展免疫防控研究具有重要意义。本文选取蜂胶佐剂和弗氏完全佐剂分别添加到杀鲑气单胞菌灭活疫苗中,然后免疫虹鳟,评价对的虹鳟相对免疫保护率,并采集虹鳟肝、脾脏、头肾和鳃组织用于RNA的提取,分析疫苗对免疫相关基因表达的影响,以期获得具有良好免疫效果的佐剂联合疫苗。本文主要内容如下:第一部分:从本实验室保藏的2014-2015年分离自大西洋鲑和虹鳟等体内的气单胞菌50株,结合革兰...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1.1 国内外虹鳟（Oncorhynchus mykiss）养殖现状
1.2 杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）主要特征
1.3 鱼用佐剂研究进展
1.3.1 佐剂分类
1.3.2 佐剂的作用机制
1.3.3 蜂胶佐剂
1.4 细胞因子
1.4.1 白细胞介素（Interlenkkin，IL）
1.4.2 干扰素（Interferon，IFN）
1.5 主要组织相容性复合物（MHC）
1.6 T细胞表面受体
1.7 免疫球蛋白（Immunoglobulin）
1.8 本研究的目的和意义
第二章 我国现行杀鲑气单胞菌的分离鉴定及特性研究
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 菌株的分离培养与形态观察
2.2.2 生理生化鉴定
2.2.3 16SrRNA序列测定
2.2.4 fstA序列测定
2.3 杀鲑气单胞菌血清型分析
2.3.1 抗原制备
2.3.2 免疫
2.4 杀鲑气单胞菌血清学分析
2.5 杀鲑气单胞疫苗候选株的筛选
2.6 实验结果
2.6.1 菌株的形态特征
2.6.2 生理生化特性
2.6.3 16SrRNA序列的PCR扩增及比对结果
2.6.4 fstA序列的PCR扩增及比对结果
2.6.5 杀鲑气单胞菌血清型结果
2.6.6 疫苗候选株筛选结果
2.7 讨论
第三章 杀鲑气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
3.1 实验材料
3.1.1 主要试剂与材料
3.1.2 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 引物设计与合成
3.2.2 引物特异性检测
3.2.3 制备质粒标准品
3.2.4 标准曲线的建立、灵敏度及重复性分析
3.2.5 SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的应用
3.3 实验结果
3.3.1 引物特异性检测
3.3.2 SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线的建立
3.3.3 灵敏度检测
3.3.4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的重复性分析
3.3.5 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法应用
3.4 讨论
第四章 不同佐剂杀鲑气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫效果的研究
4.1 实验材料
4.1.1 实验菌株
4.1.2 实验虹鳟
4.1.3 蜂胶与弗氏完全佐剂
4.1.4 实验试剂
4.2 实验方法
4.2.1 实验虹鳟暂养
4.2.2 杀鲑气单胞菌疫苗的制备
4.2.3 疫苗无菌检验和安全性检验
4.2.4 虹鳟半致死剂量（LD50）测定
4.2.5 分组、免疫与采样
4.2.6 攻毒感染与免疫相对保护率
4.2.7 RNA提取及cDNA合成
4.2.8 荧光定量PCR所用引物的设计与合成
4.2.9 荧光定量PCR检测
4.2.10 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 疫苗无菌检验和安全性检验
4.3.2 虹鳟LD50计算
4.3.3 免疫相对保护率RPS
4.3.4 荧光定量PCR所用引物的获得
4.3.5 IL-8 在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.6 IL-1β在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.7 MHCⅠ在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.8 IFN-γ在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.9 CD8在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.10 IgM在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.11 IgT在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.4 讨论
4.4.1 蜂胶佐剂与弗氏完全佐剂对虹鳟免疫效果的分析
4.4.2 细胞因子类相关基因的表达分析
4.4.3 细胞表面分子相关基因的表达分析
4.4.4 免疫球蛋白IgM和IgT基因的表达分析
结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位论文期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达[J]. 马普,孙赛红,王玉芳,李慧,刘海映,姜志强,仇雪梅,刘洋,张涛,王秀利. 生物技术通报. 2015(12)
[2]不同佐剂对大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫效果[J]. 杨星,张美彦,周勇,范玉顶,曾令兵. 水生态学杂志. 2015(05)
[3]1株乌鳢源杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离与鉴定[J]. 周冬仁,罗毅志,杭小英,施伟达,叶雪平. 海洋湖沼通报. 2015(03)
[4]鱼类MHC及其基因的研究进展[J]. 耿昕颖,王家祯,王巍,单晓枫,马红霞,高云航. 安徽农业科学. 2015(25)
[5]蜂胶作为动物疫苗佐剂的研究及应用[J]. 宋晓明,孙海芳,孙旭东,南慧静. 山东畜牧兽医. 2015(03)
[6]大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究[J]. 李绍戊,王荻,连浩淼,卢彤岩,刘红柏,尹家胜. 水生生物学报. 2015(01)
[7]鲤鱼杀鲑气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 王海娟,王利. 中国畜牧兽医. 2015(01)
[8]患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定[J]. 刘宁,时晓,杜迎春,周杰珑,刘建宏,何宏轩. 淡水渔业. 2015(01)
[9]蜂胶佐剂在兽用疫苗中的应用[J]. 王凯,何天骏,胡福良. 动物医学进展. 2013(10)
[10]大黄鱼白细胞介素8基因克隆及特征分析[J]. 王亚芳,薛良义. 生物信息学. 2013(03)
硕士论文
[1]甘肃金鳟部分形态性状对体质量的影响以及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因的SNPs与生长性状的关联分析[D]. 杨建宝.甘肃农业大学 2012
本文编号：3040536
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
引言
1.1 国内外虹鳟（Oncorhynchus mykiss）养殖现状
1.2 杀鲑气单胞菌（Aeromonas salmonicida）主要特征
1.3 鱼用佐剂研究进展
1.3.1 佐剂分类
1.3.2 佐剂的作用机制
1.3.3 蜂胶佐剂
1.4 细胞因子
1.4.1 白细胞介素（Interlenkkin，IL）
1.4.2 干扰素（Interferon，IFN）
1.5 主要组织相容性复合物（MHC）
1.6 T细胞表面受体
1.7 免疫球蛋白（Immunoglobulin）
1.8 本研究的目的和意义
第二章 我国现行杀鲑气单胞菌的分离鉴定及特性研究
2.1 实验材料
2.1.1 主要试剂
2.1.2 实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 菌株的分离培养与形态观察
2.2.2 生理生化鉴定
2.2.3 16SrRNA序列测定
2.2.4 fstA序列测定
2.3 杀鲑气单胞菌血清型分析
2.3.1 抗原制备
2.3.2 免疫
2.4 杀鲑气单胞菌血清学分析
2.5 杀鲑气单胞疫苗候选株的筛选
2.6 实验结果
2.6.1 菌株的形态特征
2.6.2 生理生化特性
2.6.3 16SrRNA序列的PCR扩增及比对结果
2.6.4 fstA序列的PCR扩增及比对结果
2.6.5 杀鲑气单胞菌血清型结果
2.6.6 疫苗候选株筛选结果
2.7 讨论
第三章 杀鲑气单胞菌SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的建立与应用
3.1 实验材料
3.1.1 主要试剂与材料
3.1.2 实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 引物设计与合成
3.2.2 引物特异性检测
3.2.3 制备质粒标准品
3.2.4 标准曲线的建立、灵敏度及重复性分析
3.2.5 SYBR-GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法的应用
3.3 实验结果
3.3.1 引物特异性检测
3.3.2 SYBR GreenⅠReal-time PCR标准曲线的建立
3.3.3 灵敏度检测
3.3.4 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR的重复性分析
3.3.5 SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR检测方法应用
3.4 讨论
第四章 不同佐剂杀鲑气单胞菌灭活疫苗对虹鳟免疫效果的研究
4.1 实验材料
4.1.1 实验菌株
4.1.2 实验虹鳟
4.1.3 蜂胶与弗氏完全佐剂
4.1.4 实验试剂
4.2 实验方法
4.2.1 实验虹鳟暂养
4.2.2 杀鲑气单胞菌疫苗的制备
4.2.3 疫苗无菌检验和安全性检验
4.2.4 虹鳟半致死剂量（LD50）测定
4.2.5 分组、免疫与采样
4.2.6 攻毒感染与免疫相对保护率
4.2.7 RNA提取及cDNA合成
4.2.8 荧光定量PCR所用引物的设计与合成
4.2.9 荧光定量PCR检测
4.2.10 数据分析
4.3 结果与分析
4.3.1 疫苗无菌检验和安全性检验
4.3.2 虹鳟LD50计算
4.3.3 免疫相对保护率RPS
4.3.4 荧光定量PCR所用引物的获得
4.3.5 IL-8 在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.6 IL-1β在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.7 MHCⅠ在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.8 IFN-γ在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.9 CD8在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.10 IgM在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.3.11 IgT在肝、脾脏、头肾和鳃中的表达
4.4 讨论
4.4.1 蜂胶佐剂与弗氏完全佐剂对虹鳟免疫效果的分析
4.4.2 细胞因子类相关基因的表达分析
4.4.3 细胞表面分子相关基因的表达分析
4.4.4 免疫球蛋白IgM和IgT基因的表达分析
结论
参考文献
致谢
攻读硕士学位论文期间发表的学术论文
【参考文献】：
期刊论文
[1]红鳍东方鲀干扰素γ基因的原核表达[J]. 马普,孙赛红,王玉芳,李慧,刘海映,姜志强,仇雪梅,刘洋,张涛,王秀利. 生物技术通报. 2015(12)
[2]不同佐剂对大鲵嗜水气单胞菌灭活疫苗的免疫效果[J]. 杨星,张美彦,周勇,范玉顶,曾令兵. 水生态学杂志. 2015(05)
[3]1株乌鳢源杀鲑气单胞菌杀鲑亚种的分离与鉴定[J]. 周冬仁,罗毅志,杭小英,施伟达,叶雪平. 海洋湖沼通报. 2015(03)
[4]鱼类MHC及其基因的研究进展[J]. 耿昕颖,王家祯,王巍,单晓枫,马红霞,高云航. 安徽农业科学. 2015(25)
[5]蜂胶作为动物疫苗佐剂的研究及应用[J]. 宋晓明,孙海芳,孙旭东,南慧静. 山东畜牧兽医. 2015(03)
[6]大西洋鲑杀鲑气单胞菌无色亚种的分离鉴定和致病性研究[J]. 李绍戊,王荻,连浩淼,卢彤岩,刘红柏,尹家胜. 水生生物学报. 2015(01)
[7]鲤鱼杀鲑气单胞菌的分离鉴定及耐药性分析[J]. 王海娟,王利. 中国畜牧兽医. 2015(01)
[8]患病细鳞鱼杀鲑气单胞菌的分离与鉴定[J]. 刘宁,时晓,杜迎春,周杰珑,刘建宏,何宏轩. 淡水渔业. 2015(01)
[9]蜂胶佐剂在兽用疫苗中的应用[J]. 王凯,何天骏,胡福良. 动物医学进展. 2013(10)
[10]大黄鱼白细胞介素8基因克隆及特征分析[J]. 王亚芳,薛良义. 生物信息学. 2013(03)
硕士论文
[1]甘肃金鳟部分形态性状对体质量的影响以及IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ基因的SNPs与生长性状的关联分析[D]. 杨建宝.甘肃农业大学 2012
本文编号：3040536
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3040536.html
