仿刺参caspase基因的克隆表达及功能研究

发布时间：2021-03-08 09:18

　　细胞凋亡（Apoptisis），是生物体在生长、分化、发育和病理变化中通过基因编码的一个细胞主动自杀的过程。Caspase（Cysteine aspartic acid specific protease）又称为半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶，在细胞凋亡、分化、增殖、坏死和炎症反应过程中起到了重要的作用。本文根据仿刺参（Apostichopus japonicus）凋亡相关的caspase基因部分序列，通过RACE扩增获得了该基因的全长cDNA序列，命名为Ajcasp1（GeneBankNo.:KC972624）。生物信息学分析发现：Ajcasp1基因全长为2100bp，包括一个1137bp编码378个氨基酸的开放阅读框，序列两端为181bp的5’UTR和782bp的3’UTR。序列分析显示，该基因编码的蛋白包括caspase家族的经典结构域N端前肽（CARDcaspase-recruitment domain结构域），P20大亚基和P10小亚基，五肽保守序列,并存在多个激活位点，化学结合位点，蛋白裂解位点，多肽结合位点和一个组氨酸激活位点等。结构域分析发现，该基因编码一个包含90个氨基... 

【文章来源】：大连海洋大学辽宁省

【文章页数】：49 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 前言
    1 棘皮动物免疫相关基因研究进展
    2 细胞凋亡机制
    3 caspase 家族概述
        3.1 caspase 家族的定义及分类
        3.2 caspase 家族成员参与的重要细胞信号通路
            3.2.1 死亡受体通路
            3.2.2 线粒体通路
            3.2.3 内质网通路
            3.2.4 各通路间的相互联系
    4 本研究的目的与意义
第二章 仿刺参 Ajcasp1 基因的克隆及生物信息学分析
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 菌株和质粒
            1.1.3 主要试剂与配制
            1.1.4 引物设计与合成
        1.2 方法
            1.2.1 总 RNA 的提取
            1.2.2 cDNA 的合成
            1.2.3 PCR 扩增 ORF 框
            1.2.4 PCR 产物特异性条带的回收与纯化
            1.2.5 目的基因片段与 PMD-18T 载体连接
            1.2.6 转化
            1.2.7 PCR 鉴定阳性克隆
            1.2.8 数据分析处理
    2 结果
        2.1 仿刺参总 RNA 的提取及检测
        2.2 仿刺参 Ajcasp1 的全长 cDNA 序列克隆
        2.3 仿刺参基因的生物信息学分析
            2.3.1 Ajcasp1 及其编码氨基酸的序列结构分析
            2.3.2 AjCASP1 蛋白的二级及三级结构预测
            2.3.3 AjCASP1 序列的同源性比较和进化树分析
    3 讨论
第三章 仿刺参 AjCASP1 重组蛋白表达及抗体制备
    1 材料和方法
        1.1 材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 菌株和质粒
            1.1.3 主要试剂与配制
            1.1.4 引物设计与合成
        1.2 方法
            1.2.1 cDNA 的合成
            1.2.2 目的基因的克隆
            1.2.3 质粒提取
            1.2.4 表达载体的构建
            1.2.5 重组蛋白的表达与鉴定
            1.2.6 重组蛋白的纯化
            1.2.7 多克隆抗体的制备
            1.2.8 血清效价的测定
            1.2.9 Western blot 分析
    2 结果
        2.1 原核表达载体的构建
        2.2 重组蛋白的表达纯化及 Western blot 分析
        2.3 多抗的制备及检测
    3 讨论
第四章 仿刺参 AjCASP1 蛋白的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 材料
            1.1.1 实验动物
            1.1.2 主要试剂与配制
            1.1.3 引物设计与合成
        1.2 方法
            1.2.1 Western blot 检测组织分布
            1.2.2 LPS 诱导后仿刺参 caspase 基因的表达水平
    2 结果
        2.1 Western blot 检测各组织中蛋白浓度
        2.2 LPS 刺激后 Ajcasp1 mRNA 表达变化
    3 讨论
结论
参考文献


【参考文献】：
期刊论文
[1]Caspase细胞凋亡通路及其在水生无脊椎动物的研究进展[J]. 和四梅,张丽莉,王艺磊,王国栋.  生物技术通报. 2013(09)
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[3]仿刺参profilin基因全长cDNA的克隆及表达分析[J]. 董颖,高杉,陈仲,杨爱馥,姜北,关晓燕,王摆,周遵春.  中国农业科技导报. 2013(02)
[4]海洋动物Toll样受体的研究进展[J]. 孙红娟,周遵春,崔军,王秀利.  生物技术通报. 2013(01)
[5]鳜胰岛素样生长因子-Ⅱ cDNA基因的克隆与表达特征[J]. 刘俊,赵金良,张敏,代威.  大连海洋大学学报. 2012(06)
[6]植物Metacaspase研究进展[J]. 马聪,孔维文.  植物学报. 2012(05)
[7]仿刺参EGFR基因的克隆与表达分析[J]. 李霞,王雪,秦艳杰,刘洋,周一兵.  水产学报. 2012(01)
[8]仿刺参性别相关基因P450c17的克隆与序列分析[J]. 田燚,张丙龙,常亚青.  中国水产科学. 2012(01)
[9]中国海棘皮动物的种类组成及区系特点[J]. 廖玉麟,肖宁.  生物多样性. 2011(06)
[10]海参免疫相关基因的研究进展[J]. 王艳玲,李东,王秀利.  生物技术通报. 2011(09)

硕士论文
[1]细胞凋亡相关的生物传感研究[D]. 彭莹.湖南大学 2012
[2]Caspase酶切位点的生物信息学分析[D]. 黄成.华中科技大学 2012



本文编号：3070809