无乳链球菌α-烯醇化酶原核表达及生物学特性研究

发布时间：2021-03-09 08:20

　　本试验以海南分离株罗非鱼源无乳链球菌基因组DNA为模板,克隆并原核表达α-烯醇化酶蛋白,并应用生物信息学对其氨基酸序列进行分析。通过α-烯醇化酶活力,纤溶酶原绑定活力确定表达重组蛋白具有活性。探究α-烯醇化酶在无乳链球菌的定位和α-烯醇化酶粘附EPC细胞的性质,初步确定其作为亚单位候选疫苗的可能性。用表达的重组蛋白作为抗原,进行小鼠体内免疫试验,探究其对小鼠的免疫保护率。通过本试验,拟对无乳链球菌α-烯醇化酶生物学特性有进一步了解,并为制备具有交叉保护力的抗无乳链球菌亚单位疫苗提供数据基础。首先,对无乳链球菌α-烯醇化酶进行克隆,成功获得含阳性质粒pMD19-T-α-Eno的克隆载体。并利用生物信息学软件对克隆的α-烯醇化酶的氨基酸序列进行分析。结果显示无乳链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列含一个烯醇化酶样结构域,不含跨膜区,且没有信号肽序列,是一个疏水蛋白。选取10种不同的致病链球菌以及4株无乳链球菌分离株的α-烯醇化酶氨基酸序列建立系统发育树,发现在检测的10种链球菌之间以及4株无乳链球菌分离株之间,α-烯醇化酶具有较高的同源性。对比无乳链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列与海豚链球菌、肺炎链球... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

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中文摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述及目的意义
    1 无乳链球菌
        1.1 概述
        1.2 传播途径
        1.3 患病症状
        1.4 血清分型
        1.5 致病机制
        1.6 毒力因子
            1.6.1 荚膜多糖
            1.6.2 唾液酸
            1.6.3 CAMP因子
            1.6.4 表面蛋白
    2 α-烯醇化酶
        2.1 概述
        2.2 纤溶酶原绑定活力
        2.3 细胞表面定位
        2.4 其他功能
    3 目的意义
第二章 无乳链球菌α-烯醇化酶的克隆和生物信息学分析
    1 试验材料
        1.1 试剂载体
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂配制
    2 试验方法
        2.1 α -烯醇化酶基因的扩增
        2.2 α-烯醇化酶基因的克隆
        2.3 α-烯醇化酶基因序列特性分析
    3 试验结果
        3.1 无乳链球菌α-烯醇化酶的克隆
        3.2 无乳链球菌α-烯醇化酶氨基酸序列分析
    4 分析与讨论
第三章 无乳链球菌α-烯醇化酶的表达和纯化
    1 试验材料
        1.1 试剂载体
        1.2 主要仪器
        1.3 主要试剂配制
    2 试验方法
        2.1 α-烯醇化酶基因表达质粒的构建
        2.2 重组蛋白的诱导表达
        2.3 诱导条件的优化
        2.4 重组蛋白的纯化
    3 试验结果
        3.1 无乳链球菌α-烯醇化酶表达载体的构建
        3.2 无乳链球菌α-烯醇化酶的表达
        3.3 重组蛋白的纯化
    4 分析与讨论
第四章 无乳链球菌α-烯醇化酶的生物学活性
    1 试验材料
        1.1 试验动物
        1.2 试剂菌株
        1.3 主要仪器
        1.4 主要试剂配制
    2 试验方法
        2.1 重组蛋白的复性
        2.2 重组蛋白酶活性测定
        2.3 重组α-烯醇化酶绑定纤溶酶原
        2.4 α-烯醇化酶重组蛋白抗体的制备
        2.5 无乳链球菌α-烯醇化酶定位
        2.6 免疫荧光检测α-烯醇化酶粘附EPC细胞
        2.7 α-烯醇化酶对EPC细胞的粘附率
    3 试验结果
        3.1 重组α-烯醇化酶酶活力测定
        3.2 重组α-烯醇化酶绑定纤溶酶原
        3.3 抗血清的制备和检测
        3.4 GBS α-烯醇化酶定位
        3.5 α-烯醇化酶粘附EPC细胞
        3.6 α-烯醇化酶对EPC细胞的粘附率
    4 分析与讨论
        4.1 重组蛋白烯醇化酶活力
        4.2 α-烯醇化酶绑定纤溶酶原
        4.3 α-烯醇化酶表面定位和粘附
        4.4 α-烯醇化酶作为预防无乳链球菌病的候选抗原
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]海豚链球菌C5a肽酶功能活性区域表达及其对斑点叉尾（鱼回）（Ictalurus punctatus）的免疫保护作用[J]. 郑宗林,汪开毓,肖孟玮,王均,李岚敏,贺扬,陈德芳,黄凌远.  海洋与湖沼. 2013(05)
[2]无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）三重PCR快速检测方法的建立与应用[J]. 黄锦炉,汪开毓,肖丹,刘贝贝,王均,黄凌远,付希,王浩丞.  海洋与湖沼. 2012(02)
[3]广东与海南养殖罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定与特性分析[J]. 卢迈新,黎炯,叶星,邓国成,江小燕,田园园,赖翠玲.  微生物学通报. 2010(05)
[4]无乳链球菌的研究进展[J]. 沈定树,周雪艳.  中国微生态学杂志. 2008(05)
[5]罗非鱼无乳链球菌的分离、鉴定及致病性研究[J]. 张新艳,樊海平,钟全福,卓玉琛,林煜,曾占壮.  水产学报. 2008(05)
[6]无乳链球菌CAMP因子（cfb）的克隆及原核表达质粒的构建[J]. 王向柳,王长法,杨少华,杨宏军,阿合买提·买买提,高运东,仲跻峰.  西南农业学报. 2008(04)
[7]信号肽及其在蛋白质表达中的应用[J]. 韦雪芳,王冬梅,刘思,周鹏.  生物技术通报. 2006(06)
[8]生物信息学及其研究进展[J]. 陈润生.  医学研究通讯. 2002(12)
[9]包涵体蛋白体外复性的研究进展[J]. 方敏,黄华樑.  生物工程学报. 2001(06)
[10]某奶牛场临床型乳房炎的病原分离及鉴定[J]. 张信军,李玉军,庄国宏,焦库华.  畜牧与兽医. 2000(05)



本文编号：3072569