mstn基因降低鱼类脂肪沉积的作用研究
发布时间：2021-03-29 10:42
肌肉内的脂肪含量在调控鱼类肌肉品质上发挥着重要作用,在一定范围内如何增加肌肉内的脂肪含量来达到改善肌肉的嫩度和风味等特性的目的是养殖业中热门的研究课题之一。肌肉生长抑制素myostatin属于转化生长因子β（TGFβ）超家族中的一员,负调控动物体骨骼肌的生长发育水平。前人研究证实mstn参与调控骨骼肌等组织中的多种代谢过程如脂肪代谢、糖代谢等。本实验重点研究mstn参与肌肉内脂肪代谢过程相关机制及功能作用。通过构建mstn敲除型泥鳅和构建mstn敲降胖头鲤细胞系模型,从活体和离体两方面来研究肌肉组织及肌肉细胞中脂肪代谢的情况来探究mstn在其中发挥的作用,并通过实时定量PCR、蛋白免疫印迹、Oil Red O染色、H&E染色、脂质组学研究等多种生化、细胞和分子检测方法研究其作用与机制。获得的主要结果如下:（1）.mstn基因缺失能显著促进肌肉组织发育,但在促进肌肉组织发育的同时,会减少肌肉组织中的脂肪合成,LC-MS分析表明mstn缺失显著影响了泥鳅肌肉组织中的脂质组分,甘油三酯含量显著减少,此外,还发现mstn缺失型泥鳅肌肉组织中ATP含量明显低于野生型,因此猜测mstn调控...
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
泥鳅mstn基因（mRNA）不同组织中的表达分析
mstn基因降低鱼类脂肪沉积的作用研究17蛋白质的编码产生的影响可能更大，具体的靶位点序列如下：靶位点：5’-GGACCAGTACGGTGTGCTGG-3’靶位点与一段特定的序列结合合成特异性gRNA的PCR正向引物，序列如下：gRNA-F：TGTAATACGACTCACTATAGGACCAGTACGGTGTGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATgRNA-R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA3.2.2敲除模型的成功构建如图2.2为泥鳅mstn的突变模型，靶位点设计于第一外显子，通过PCR产物测序筛选泥鳅突变类型，测序峰图如图显示，该突变是mstn基因第一个外显子核苷酸位置287的T到G过渡，使得MSTN蛋白第95位密码子的翻译过早导致突变，我们将此种突变定义为MU。图2.2通过CRISPR/Cas9技术构建泥鳅mstn突变模型Fig2.1MSTN-depletionloaches(MUforshort)producedbyCRISPR/Cas93.3qPCR和WesternBlot检测mstn基因表达为了分析mstn基因的敲除效果，通过在cDNA序列上设计定量引物及自制兔多克隆抗体分别从mRNA及蛋白水平检测了mstn基因表达情况，检测结果如图2.3所示。从qPCR结果分析得出与对照组野生型泥鳅相比，MU泥鳅mstn基因mRNA的表达量显著降低（2.3A）；Westernblot结果也证明了MU型泥鳅mstn基因的蛋白表达量显著低于对照组（2.3B）。检测结果分析表示我们成功获得了mstn基因敲除的二倍体泥鳅模型。
华中农业大学2020届硕士研究生学位论文18AB图2.3mstn基因mRNA和蛋白水平的表达分析。（A）MU与WT泥鳅肌肉组织mstn基因的mRNA的表达分析；（B）WesternBlot分析敲除型与野生型泥鳅肌肉组织中mstn基因蛋白的表达。Fig2.3(A)TranscriptionalexpressionlevelsofmusclemstninWT(F1wild-typeloaches)andMU.(B)MSTNproteinlevelsinmuscletissuesofWTandMU.3.4mstn缺失对泥鳅生长发育的影响将mstn缺失的突变型泥鳅与野生型对照组泥鳅按照严格统一的方式养殖，每15尾养殖于15L的白色鱼缸中，保持28°C循环水喂养，光/暗周期为14h/10h，一日三次投喂，定时定量投喂鲜活水蚯蚓，定期换水，分别在30d、60d、90d、120d生长期下记录泥鳅体长体重情况，并做好拍照工作，从结果可以发现，mstn缺失型泥鳅的肌肉发育程度显著强于对照组泥鳅，90d时的对比情况如图2.4A所示。与此同时，mstn缺失对泥鳅体长并无显著影响，但是对体重以及体高有着明显的促进作用，如果2.4B所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类脂肪酸β-氧化研究进展[J]. 宁丽军,李加敏,孙胜香,杜震宇. 水产学报. 2019(01)
[2]不同脂肪源对泥鳅稚鱼生长性能及脂肪酸组成的影响[J]. 高坚,李洋,叶伟钊,王卫民,曹小娟. 水生生物学报. 2016(01)
[3]CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用[J]. 幸宇云,杨强,任军. 遗传. 2016(03)
[4]一种新的基因敲除术-RNAi[J]. 李颖平,张映,邵国青. 生物技术通报. 2006(03)
[5]RNAi技术在转基因动物中的应用[J]. 尹秀山,张令强,贺福初. 遗传. 2006(03)
本文编号：3107417
【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：71 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
泥鳅mstn基因（mRNA）不同组织中的表达分析
mstn基因降低鱼类脂肪沉积的作用研究17蛋白质的编码产生的影响可能更大，具体的靶位点序列如下：靶位点：5’-GGACCAGTACGGTGTGCTGG-3’靶位点与一段特定的序列结合合成特异性gRNA的PCR正向引物，序列如下：gRNA-F：TGTAATACGACTCACTATAGGACCAGTACGGTGTGCTGGGTTTTAGAGCTAGAAATgRNA-R：AAAGCACCGACTCGGTGCCA3.2.2敲除模型的成功构建如图2.2为泥鳅mstn的突变模型，靶位点设计于第一外显子，通过PCR产物测序筛选泥鳅突变类型，测序峰图如图显示，该突变是mstn基因第一个外显子核苷酸位置287的T到G过渡，使得MSTN蛋白第95位密码子的翻译过早导致突变，我们将此种突变定义为MU。图2.2通过CRISPR/Cas9技术构建泥鳅mstn突变模型Fig2.1MSTN-depletionloaches(MUforshort)producedbyCRISPR/Cas93.3qPCR和WesternBlot检测mstn基因表达为了分析mstn基因的敲除效果，通过在cDNA序列上设计定量引物及自制兔多克隆抗体分别从mRNA及蛋白水平检测了mstn基因表达情况，检测结果如图2.3所示。从qPCR结果分析得出与对照组野生型泥鳅相比，MU泥鳅mstn基因mRNA的表达量显著降低（2.3A）；Westernblot结果也证明了MU型泥鳅mstn基因的蛋白表达量显著低于对照组（2.3B）。检测结果分析表示我们成功获得了mstn基因敲除的二倍体泥鳅模型。
华中农业大学2020届硕士研究生学位论文18AB图2.3mstn基因mRNA和蛋白水平的表达分析。（A）MU与WT泥鳅肌肉组织mstn基因的mRNA的表达分析；（B）WesternBlot分析敲除型与野生型泥鳅肌肉组织中mstn基因蛋白的表达。Fig2.3(A)TranscriptionalexpressionlevelsofmusclemstninWT(F1wild-typeloaches)andMU.(B)MSTNproteinlevelsinmuscletissuesofWTandMU.3.4mstn缺失对泥鳅生长发育的影响将mstn缺失的突变型泥鳅与野生型对照组泥鳅按照严格统一的方式养殖，每15尾养殖于15L的白色鱼缸中，保持28°C循环水喂养，光/暗周期为14h/10h，一日三次投喂，定时定量投喂鲜活水蚯蚓，定期换水，分别在30d、60d、90d、120d生长期下记录泥鳅体长体重情况，并做好拍照工作，从结果可以发现，mstn缺失型泥鳅的肌肉发育程度显著强于对照组泥鳅，90d时的对比情况如图2.4A所示。与此同时，mstn缺失对泥鳅体长并无显著影响，但是对体重以及体高有着明显的促进作用，如果2.4B所示。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类脂肪酸β-氧化研究进展[J]. 宁丽军,李加敏,孙胜香,杜震宇. 水产学报. 2019(01)
[2]不同脂肪源对泥鳅稚鱼生长性能及脂肪酸组成的影响[J]. 高坚,李洋,叶伟钊,王卫民,曹小娟. 水生生物学报. 2016(01)
[3]CRISPR/Cas9基因组编辑技术在农业动物中的应用[J]. 幸宇云,杨强,任军. 遗传. 2016(03)
[4]一种新的基因敲除术-RNAi[J]. 李颖平,张映,邵国青. 生物技术通报. 2006(03)
[5]RNAi技术在转基因动物中的应用[J]. 尹秀山,张令强,贺福初. 遗传. 2006(03)
本文编号：3107417
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