Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒外衣壳蛋白的免疫原性及其相互作用宿主蛋白的初步研究
发布时间：2021-04-07 05:25
草鱼呼肠孤病毒属于水生呼肠孤病毒属,是危害草鱼最严重的病毒性病原,其中Ⅱ型GCRV为当前我国流行最广的毒株。Ⅱ型GCRV包含11条ds RNA,其中S6编码的VP4、S11编码的VP35以及S7编码的VP56蛋白据推测为病毒的外衣壳蛋白,其在病毒进入细胞过程中起着重要作用并且能够诱导宿主产生适应性免疫,对其开展研究有助于了解Ⅱ型GCRV的致病机制以及建立免疫学检测方法。本实验对Ⅱ型GCRV外衣壳蛋白基因进行了克隆,并对蛋白进行了表达纯化及多克隆抗体制备,分析了外衣壳蛋白的免疫原性,并用酵母双杂交系统鉴定了与其作用的潜在宿主蛋白,本研究包含了以下四个方面:1.Ⅱ型GCRV外衣壳蛋白基因S6的原核表达,多克隆抗体的制备,免疫原性及其相互作用宿主蛋白分析试验根据HZ08株S6基因序列,设计构建p GEX-4t-3-S6和p GBKT7-VP4重组质粒的引物,提取感染了GCRV JX02毒株的CIK总RNA,采用RT-PCR技术扩增获得约1954bp的S6目的片段。将基因S6克隆到p GEX-4t-3载体中,并转化入Escherichia coli BL21（DE3）中。SDS-PAGE检测诱...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
6基因PCR扩增产物电泳图
2.3 重组蛋白 rVP4 的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE结果显示，经诱导的菌体沉淀于98ku位置显现出明显的目的蛋白条带，但在未诱导的菌体中则没有发现该目的条带 (图2)。由于rVP4主要出现在沉淀中，所以本试验揭示rVP4主要是以包涵体的形式存在。图2 重组蛋白rVP4的诱导表达及可溶性分析M.蛋白质marker；1. 未诱导细菌沉淀；2. 诱导细菌沉淀；3.诱导细菌超声破碎后的上清；4. 诱导细菌超声破碎后的沉淀Fig.2 Induced expression and solubility analysis of rVP4 proteinM.protein marker;1.the precipitate of uninduced bacterial control;2.the precipitate of inducedbacterial control;3.the supernatant of induced bacyterial after ultrasonic;4.the precipitate of inducedbacterial after ultrasonic2.4 rVP4 表达条件的优化及纯化SDS-PAGE结果对比发现，0.1mmol/L 浓度的IPTG诱导时，rVP4的目标条带较为明显，证明rVP4能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP4的表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP4的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图 3 不同浓度 IPTG 对 rVP4 的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2. 0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3. 0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4. 0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5. 0.7mm浓度诱?
证明rVP4能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP4的表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP4的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图 3 不同浓度 IPTG 对 rVP4 的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2. 0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3. 0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4. 0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5. 0.7mm浓度诱导的菌体沉淀
【参考文献】：
期刊论文
[1]人脑中硒蛋白W与鞘脂激活蛋白原相互作用的筛选与验证[J]. 陈平,刘晴,马孝杰,王诗捷,刘琼,倪嘉缵. 生物化学与生物物理进展. 2014(08)
[2]草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析[J]. 李永刚,曾伟伟,王庆,殷亮,王英英,梁红茹,刘春,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2014(03)
[3]酵母双杂交及其衍生系统[J]. 黄欣媛,范红波. 生物技术通报. 2014(01)
[4]利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白[J]. 李杰,闫秀英,丁燏,吴灶和,简纪常,谢吉国. 海洋与湖沼. 2013(02)
[5]草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 曾伟伟,王庆,王英英,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2013(03)
[6]草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用[J]. 曾伟伟,王庆,王英英,张乐生,刘宝芹,石存斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2013(02)
[7]草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析[J]. 王杭军,叶星,田园园,张莉莉,邓国成. 水产学报. 2013(01)
[8]应用dsRNA测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染[J]. 王土,许丹,吕利群. 上海海洋大学学报. 2012(05)
[9]草鱼呼肠孤病毒HZ08株S4基因序列分析[J]. 曾伟伟,王庆,张超,张乐生,刘宝芹,刘永奎,石存斌,吴淑勤. 生物学杂志. 2012(02)
[10]一株草鱼呼肠孤病毒检测用单克隆抗体的制备及其特性[J]. 杨倩,曹海鹏,和永杏,姜有声,吕利群. 中国免疫学杂志. 2012(03)
硕士论文
[1]桃拉综合症病毒和草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白抗体的制备与分析[D]. 杨倩.上海海洋大学 2012
本文编号：3122889
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：65 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
6基因PCR扩增产物电泳图
2.3 重组蛋白 rVP4 的诱导表达及可溶性分析SDS-PAGE结果显示，经诱导的菌体沉淀于98ku位置显现出明显的目的蛋白条带，但在未诱导的菌体中则没有发现该目的条带 (图2)。由于rVP4主要出现在沉淀中，所以本试验揭示rVP4主要是以包涵体的形式存在。图2 重组蛋白rVP4的诱导表达及可溶性分析M.蛋白质marker；1. 未诱导细菌沉淀；2. 诱导细菌沉淀；3.诱导细菌超声破碎后的上清；4. 诱导细菌超声破碎后的沉淀Fig.2 Induced expression and solubility analysis of rVP4 proteinM.protein marker;1.the precipitate of uninduced bacterial control;2.the precipitate of inducedbacterial control;3.the supernatant of induced bacyterial after ultrasonic;4.the precipitate of inducedbacterial after ultrasonic2.4 rVP4 表达条件的优化及纯化SDS-PAGE结果对比发现，0.1mmol/L 浓度的IPTG诱导时，rVP4的目标条带较为明显，证明rVP4能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP4的表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP4的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图 3 不同浓度 IPTG 对 rVP4 的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2. 0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3. 0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4. 0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5. 0.7mm浓度诱?
证明rVP4能达到较高的表达量；而随着IPTG浓度提高时目标条带并无明显的变化，证明rVP4的表达量并无显著性增减，所以根据本实验室之前蛋白诱导经验，把rVP4的IPTG浓度定为0.3mmol/L即能够达到很好的诱导效果（图3）。图 3 不同浓度 IPTG 对 rVP4 的诱导效果M.蛋白质marker；1.未诱导菌体的沉淀；2. 0.1mm浓度诱导的菌体沉淀；3. 0.3mm浓度诱导的菌体沉淀；4. 0.5mm浓度诱导的菌体沉淀；5. 0.7mm浓度诱导的菌体沉淀
【参考文献】：
期刊论文
[1]人脑中硒蛋白W与鞘脂激活蛋白原相互作用的筛选与验证[J]. 陈平,刘晴,马孝杰,王诗捷,刘琼,倪嘉缵. 生物化学与生物物理进展. 2014(08)
[2]草鱼呼肠孤病毒HZ08株S10编码蛋白多克隆抗体制备及其特性分析[J]. 李永刚,曾伟伟,王庆,殷亮,王英英,梁红茹,刘春,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2014(03)
[3]酵母双杂交及其衍生系统[J]. 黄欣媛,范红波. 生物技术通报. 2014(01)
[4]利用酵母双杂交系统筛选草鱼呼肠孤病毒NS38相互作用蛋白[J]. 李杰,闫秀英,丁燏,吴灶和,简纪常,谢吉国. 海洋与湖沼. 2013(02)
[5]草鱼呼肠孤病毒HZ08株VP4蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 曾伟伟,王庆,王英英,石存斌,吴淑勤. 水产学报. 2013(03)
[6]草鱼呼肠孤病毒三重PCR检测方法的建立及其应用[J]. 曾伟伟,王庆,王英英,张乐生,刘宝芹,石存斌,吴淑勤. 中国水产科学. 2013(02)
[7]草鱼呼肠孤病毒GCRV-GD108株VP5蛋白功能及免疫原性分析[J]. 王杭军,叶星,田园园,张莉莉,邓国成. 水产学报. 2013(01)
[8]应用dsRNA测序技术检测草鱼呼肠孤病毒的混合感染[J]. 王土,许丹,吕利群. 上海海洋大学学报. 2012(05)
[9]草鱼呼肠孤病毒HZ08株S4基因序列分析[J]. 曾伟伟,王庆,张超,张乐生,刘宝芹,刘永奎,石存斌,吴淑勤. 生物学杂志. 2012(02)
[10]一株草鱼呼肠孤病毒检测用单克隆抗体的制备及其特性[J]. 杨倩,曹海鹏,和永杏,姜有声,吕利群. 中国免疫学杂志. 2012(03)
硕士论文
[1]桃拉综合症病毒和草鱼呼肠孤病毒外壳蛋白抗体的制备与分析[D]. 杨倩.上海海洋大学 2012
本文编号：3122889
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