鮸鱼（Miichthys miiuy）自然杀伤细胞增强因子基因克隆及表达分析

发布时间：2021-04-09 22:54

　　自然杀伤细胞增强因子（Naturalkillerenhancingfactor,NKEF）于1993年在人类的红细胞中被分离纯化，成为了Peroxiredoxin（Prx）抗氧化蛋白家族一个重要的成员。因为在体外可以增强自然杀伤细胞对肿瘤细胞的细胞毒效应，所以被命名为自然杀伤细胞增强因子。为了研究硬骨鱼中NKEF的免疫防御机制，在本篇论文中，我们采用快速扩增cDNA末端（rapidamplificationofcDNAends,RACE）的方法，经过凝胶回收、连接、转化、阳性克隆子的检测和测序后，得到鮸鱼NKEF-A全长cDNA序列。鮸鱼NKEF-AcDNA全长为1235bp，其中包括47bp的5’非翻译区，597bp的开放阅读框和591bp的3’非翻译区，整个开放阅读框编码198个氨基酸。鮸鱼NKEF-A的蛋白分子量约为23kDa，在其蛋白质序列中，含有三个半胱氨酸残基（Cys），其中第52位和173位上的半胱氨酸残基分别存在于两个高度保守的VCP信号上，通过比对其他几种I类抗氧化蛋白家族成员后，发现这两个位置的半胱氨酸残基也是非常保守的，并且是Prx家族蛋白发挥其生物学功能的氨基酸... 

【文章来源】：浙江海洋大学浙江省

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
目录
第一章 文献综述
    1.1 ROS简述
        1.1.1 ROS的概念
        1.1.2 ROS产生的途径
        1.1.3 ROS的功能
        1.1.4 ROS的消除
    1.2 Prx家族概述
        1.2.1 Prx家族的分类概况
        1.2.2 Prx蛋白家族的功能及作用机制
    1.3 自然杀伤细胞增强因子
        1.3.1 NKEF的发现
        1.3.2 鱼类NKEF基因的发现及克隆
        1.3.3 NKEF的生物学功能
    1.4 鮸鱼NKEF基因研究的意义
第二章 鮸鱼NKEF基因的克隆
    2.1 实验材料与方法
        2.1.1 实验材料采集
        2.1.2 DNA/RNA的提取及cDNA的合成
        2.1.3 引物设计
        2.1.4 扩增鮸鱼NKEF-A基因
        2.1.5 扩增产物的回收与纯化
        2.1.6 目的片段的连接转化
        2.1.7 菌落PCR检测及测序
    2.2 实验结果
        2.2.1 DNA/RNA的提取
        2.2.2 鮸鱼NKEF-A基因的克隆
        2.2.3 鮸鱼NKEF-A基因的序列拼装与提交
        2.2.4 鮸鱼NKEF-A基因结构分析
        2.2.5 鮸鱼NKEF-A氨基酸序列比对分析
        2.2.6 鮸鱼NKEF-A进化树构建
    2.3 讨论
        2.3.1 鮸鱼NKEF-A基因的克隆
        2.3.2 鮸鱼NKEF-A基因氨基酸序列比对及系统发育树
第三章 鮸鱼NKEF-A基因的表达分析
    3.1 实验材料与方法
        3.1.1 实验材料的采集
        3.1.2 实验方法
    3.2 实验结果
        3.2.1 NKEF-A基因在鮸鱼不同组织中的表达
        3.2.2 鳗弧菌侵染后NKEF-A基因在组织中的表达
    3.3 讨论
第四章 鮸鱼NKEF-A基因蛋白的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备
    4.1 鮸鱼克隆载体pMD-NKEF-A质粒的构建
        4.1.1 材料和方法
        4.1.2 实验结果
    4.2 重组表达载体pET-NKEF质粒的构建
        4.2.1 实验方法
        4.2.2 实验结果
    4.3 重组质粒pET-NKEF的诱导表达
        4.3.1 实验方法
        4.3.2 实验结果
    4.4 多克隆抗体制备
        4.4.1 实验方法
        4.4.2 Westernblot分析
        4.4.3 实验结果
    4.5 讨论
参考文献
致谢
在读期间发表的学术论文及研究成果
附表


【参考文献】：
期刊论文
[1]抗氧化蛋白Peroxiredoxin家族研究进展[J]. 章波,向渝梅,白云.  生理科学进展. 2004(04)
[2]鳗弧菌灭活疫苗对牙鲆免疫效果的研究[J]. 高冬梅,李健,王群.  海洋水产研究. 2004(01)
[3]鳗弧菌感染牙鲆的组织学和免疫组织化学观察[J]. 夏永娟,黄威权,姜国良.  海洋科学. 2000(10)
[4]鲈鱼苗烂鳃、烂尾病病原菌的研究[J]. 肖慧,李军,王祥红,纪伟尚,徐怀恕.  青岛海洋大学学报(自然科学版). 1999(01)



本文编号：3128453