草鱼呼肠孤病毒拮抗宿主细胞RNA干扰信号通路的机制研究
发布时间：2021-04-17 06:28
草鱼呼肠孤病毒隶属于水生呼肠孤病毒属，是引起草鱼出血病的主要病原。该病毒基因组由11条双链RNA组成，共编码7个结构蛋白和5个非结构蛋白。GCRV导致宿主细胞融合、凋亡、应急颗粒产生等病理变化。GCRV的双链RNA能够在病毒正常复制周期避免结合Dicer并逃逸宿主RNAi抗病毒作用通路。本文利用RACE技术、Real-time PCR、细胞转染等方法对以下三个方面进行研究：1.草鱼Dicer基因的克隆与表达在RNAi介导的沉默机制中, Dicer发挥着重要的作用。本研究通过同源克隆方法和RACE技术获得草鱼Dicer cDNA序列,其开放阅读框为5646bp，编码1881个氨基酸。草鱼Dicer含有其他生物Dicer的所有结构域。在草鱼脑、鳃、头肾、肝脏、脾脏、心脏、肌肉、和肠8个不同组织中,Dicer基因均有分布。GCRV感染CIK细胞条件下，Dicer表达在24h时上调，与对照组显著性差异。同样在Poly（I:C）刺激CIK细胞条件下，Dicer表达在2h时上调，与对照组显著性差异。不同组织的时序表达研究结果显示,在肝脏中,草鱼Dicer在病毒感染12h时表达量开始上调,且与对照组...
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GCRV基因组及其编码蛋白
图 2 RNaseIII 家族的结构域和 RNaseIII 基因家族的三种类型Domain organization of RNaseIII gene family and three classes of RNaseIII genes are icer 结构域的功能目前已经证明 Helicase 使 Dicer 酶沿着 dsRNA 移动或者使 dsRNA 解链于 Dicer 酶的切割。RNaseIII 结构域能够与底物 dsRNA 结合，dsRBD 结剪切 RNA 底物, PAZ 结构域有助于识别 dsRNA 底物并与其相结合, DU域的功能不明[67]。icer 的功能Dicer 对 miRNA 和 siRNA 的产生中发挥作用，miRNA 的产生分两步：胞核中，RNase III Drosha 将 pri-miRNA 转化为 70nt 茎环结构的 pre-m Pre-miRNA 被转运到细胞质，被 Dicer 切割为 21-23 nt 的成熟 miRNA[6
(9) 向纯化柱内加入 400μl 纯化柱洗涤液。14000rpm, 30s.10)将纯化柱连接到一个干净的 1.5ml 离心管上，直接向纯化柱加入 30μl 洗脱缓。在室温下静置 1min.(11) 14000rpm, 15s, 用于洗脱质粒 DNA。盖紧离心管的盖子，将洗脱下来粒 DNA 存储于-20℃..5.7cDNA 末端快速扩增技术 RACE根据 cDNA 末端序列快速扩增(Rapid Amplification of cDNA End, RACE)试操作说明,从而获得目的基因的5'端和3'末端cDNA 序列,进而得到其cDNA全列。其操作原理如下：
【参考文献】：
期刊论文
[1]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[2]NP基因特异性干扰RNA抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的研究[J]. 张伟,王承宇,杨松涛,高玉伟,夏咸柱. 中国病原生物学杂志. 2009(10)
[3]化学合成小干扰RNA分子高效抑制草鱼呼肠孤病毒复制[J]. 李兵,范玉顶,李艳秋,徐进,周勇,曾令兵. 病毒学报. 2009(05)
[4]RNAi在抗HIV-1中的应用研究进展[J]. 陈保锋,张东,孙景梅,张杰. 生物技术通报. 2008(02)
[5]Dicer酶及其在RNA干扰中的作用[J]. 胡妙凤,尚世强. 医学分子生物学杂志. 2006(06)
[6]草鱼呼肠孤病毒的研究进展[J]. 肖雪,颜其贵,欧洋,曹洪志,樊汶樵,李冰,赖维莉,张传斌,周磊,冯婷,林涛,刘亚. 水利渔业. 2006(05)
[7]RNA干涉及其技术的应用[J]. 俞宁,岳华,王建林. 中国家禽. 2005(20)
[8]草鱼呼肠孤病毒的三维重构与衣壳蛋白特性[J]. 方勤,Sanket Shah. 中国科学C辑:生命科学. 2005(03)
[9]病毒编码的转录后沉默抑制蛋白[J]. 燕飞,成卓敏. 生命的化学. 2004(04)
[10]草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析[J]. 方勤,肖调义,丁清泉,李旅,章怀云,朱作言. 中国病毒学. 2002(02)
博士论文
[1]用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究[D]. 陈芸.中国科学院研究生院（水生生物研究所） 2005
本文编号：3142968
【文章来源】：上海海洋大学上海市
【文章页数】：66 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
GCRV基因组及其编码蛋白
图 2 RNaseIII 家族的结构域和 RNaseIII 基因家族的三种类型Domain organization of RNaseIII gene family and three classes of RNaseIII genes are icer 结构域的功能目前已经证明 Helicase 使 Dicer 酶沿着 dsRNA 移动或者使 dsRNA 解链于 Dicer 酶的切割。RNaseIII 结构域能够与底物 dsRNA 结合，dsRBD 结剪切 RNA 底物, PAZ 结构域有助于识别 dsRNA 底物并与其相结合, DU域的功能不明[67]。icer 的功能Dicer 对 miRNA 和 siRNA 的产生中发挥作用，miRNA 的产生分两步：胞核中，RNase III Drosha 将 pri-miRNA 转化为 70nt 茎环结构的 pre-m Pre-miRNA 被转运到细胞质，被 Dicer 切割为 21-23 nt 的成熟 miRNA[6
(9) 向纯化柱内加入 400μl 纯化柱洗涤液。14000rpm, 30s.10)将纯化柱连接到一个干净的 1.5ml 离心管上，直接向纯化柱加入 30μl 洗脱缓。在室温下静置 1min.(11) 14000rpm, 15s, 用于洗脱质粒 DNA。盖紧离心管的盖子，将洗脱下来粒 DNA 存储于-20℃..5.7cDNA 末端快速扩增技术 RACE根据 cDNA 末端序列快速扩增(Rapid Amplification of cDNA End, RACE)试操作说明,从而获得目的基因的5'端和3'末端cDNA 序列,进而得到其cDNA全列。其操作原理如下：
【参考文献】：
期刊论文
[1]Suppression of RNA Interference Pathway in vitro by Grass Carp Reovirus[J]. Shuai Guo1#, Dan Xu1#, Hong-xu Xu2, Tu Wang1, Jia-le Li1 and Li-qun Lu1** (1. Key Laboratory of Aquatic Genetic Resources and Utilization /Ministry of Agriculture, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Department of Laboratory Medicine, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, Guangzhou 510080, China). Virologica Sinica. 2012(02)
[2]NP基因特异性干扰RNA抑制H5N1高致病性禽流感病毒复制的研究[J]. 张伟,王承宇,杨松涛,高玉伟,夏咸柱. 中国病原生物学杂志. 2009(10)
[3]化学合成小干扰RNA分子高效抑制草鱼呼肠孤病毒复制[J]. 李兵,范玉顶,李艳秋,徐进,周勇,曾令兵. 病毒学报. 2009(05)
[4]RNAi在抗HIV-1中的应用研究进展[J]. 陈保锋,张东,孙景梅,张杰. 生物技术通报. 2008(02)
[5]Dicer酶及其在RNA干扰中的作用[J]. 胡妙凤,尚世强. 医学分子生物学杂志. 2006(06)
[6]草鱼呼肠孤病毒的研究进展[J]. 肖雪,颜其贵,欧洋,曹洪志,樊汶樵,李冰,赖维莉,张传斌,周磊,冯婷,林涛,刘亚. 水利渔业. 2006(05)
[7]RNA干涉及其技术的应用[J]. 俞宁,岳华,王建林. 中国家禽. 2005(20)
[8]草鱼呼肠孤病毒的三维重构与衣壳蛋白特性[J]. 方勤,Sanket Shah. 中国科学C辑:生命科学. 2005(03)
[9]病毒编码的转录后沉默抑制蛋白[J]. 燕飞,成卓敏. 生命的化学. 2004(04)
[10]草鱼呼肠孤病毒新分离株(GCRV991)的病毒学特性分析[J]. 方勤,肖调义,丁清泉,李旅,章怀云,朱作言. 中国病毒学. 2002(02)
博士论文
[1]用RNA干扰（RNAi）抗草鱼出血病病毒的初步研究[D]. 陈芸.中国科学院研究生院（水生生物研究所） 2005
本文编号：3142968
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