迟缓爱德华氏菌抗原蛋白FBA在毕赤酵母中的重组表达及抗原表位筛选

发布时间：2021-04-20 13:20

　　迟缓爱德华氏菌是海水养殖鱼类的主要致病菌,属胞内寄生菌,传统抗生素难以防治,本实验室致力于研究其致病机制和疫苗的开发。前期研究发现,通过大肠杆菌重组表达该病原菌的持家酶果糖1,6-二磷酸醛缩酶（FBA）,免疫斑马鱼和大菱鲆后,对Edwardsiella tarda均具有较好的免疫保护力,是爱德华氏菌病亚单位疫苗开发的优良候选抗原。使用大肠杆菌进行重组表达会产生内毒素。本文将抗原蛋白FBA在毕赤酵母中进行重组表达,以期避免内毒素问题并且实现抗原蛋白FBA大规模制备,进而将其应用于水产养殖新型疫苗开发中。本工作完成了重组表达FBA的毕赤酵母菌株GS115-pPIC9K::fba和GS115-pGAPZαA::fba的构建,摇瓶培养条件下检测甲醇诱导型重组毕赤酵母GS115-pPIC9K::fba对FBA蛋白的表达情况,发现经甲醇诱导后重组FBA能被成功诱导表达。随后将GS115-pPIC9K::fba经5L发酵罐培养,发酵液上清中FBA的浓度可达1.06g/L,并通过镍柱亲和层析完成了其纯化。对纯化后的重组FBA进行免疫效果评价,其免疫斑马鱼和大菱鲆后均具有较好的免疫保护效力。并且重组酵母... 

【文章来源】：华东理工大学上海市 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：75 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第1章 文献综述
    1.1 水产养殖
    1.2 迟缓爱德华氏菌
    1.3 果糖1,6二磷酸醛缩酶FBA
        1.3.1 FBA在糖酵解中的催化作用
        1.3.2 FBA的亚细胞定位
        1.3.3 FBA的免疫原性
    1.4 毕赤酵母表达系统
        1.4.1 毕赤酵母表达系统的优势
        1.4.2 毕赤酵母表达载体
        1.4.3 毕赤酵母表达的外源蛋白
        1.4.4 毕赤酵母的发酵调控
    1.5 抗原表位的筛选
        1.5.1 抗原表位
        1.5.2 常用抗原表位筛选方法
    1.6 本课题研究意义
第2章 E. tarda抗原蛋白FBA在毕赤酵母中的表达
    2.1 前言
    2.2 实验材料
        2.2.1 载体与菌株
        2.2.2 实验动物
        2.2.3 实验试剂
        2.2.4 引物设计及数据处理软件
    2.3 实验方法
        2.3.1 FBA毕赤酵母表达株的构建
        2.3.2 重组毕赤酵母的摇瓶培养和蛋白检测
        2.3.3 重组毕赤酵母GS115-pPIC9K::fba的发酵培养
        2.3.4 重组FBA蛋白的纯化
        2.3.5 Bradford法检测纯化后蛋白浓度
        2.3.6 重组FBA的免疫原性检测
    2.4 实验结果与讨论
        2.4.1 FBA毕赤酵母表达株的构建
        2.4.2 GS1 15-pPIC9K::fba的摇瓶培养和蛋白表达检测
        2.4.3 GS1 15-pPIC9K::fba的发酵罐培养和蛋白检测
        2.4.4 重组FBA蛋白的亲和纯化
        2.4.5 重组FBA蛋白免疫原性检测
    2.5 本章小结
第3章 E. tarda抗原蛋白FBA的表位筛选
    3.1 前言
    3.2 实验材料
        3.2.1 实验动物
        3.2.2 载体和菌株
        3.2.3 实验试剂
        3.2.4 引物设计及数据处理软件
    3.3 实验方案
        3.3.1 构建方案
        3.3.2 EIB202基因组的抽提
        3.3.3 重组质粒pET28a::△fba的构建
        3.3.4 △FBA蛋白的表达检测及纯化
        3.3.5 △FBA蛋白对斑马鱼免疫效果的评价实验
        3.3.6 AFBA蛋白与抗血清反应性检测实验
    3.4 结果与讨论
        3.4.1 FBA表位在线预测结果
        3.4.2 重组质粒pET28a::△fba的构建
        3.4.3 △FBA蛋白的表达检测及纯化
        3.4.4 △FBA蛋白对斑马鱼免疫效果的评价
        3.4.5 △FBA蛋白与抗血清反应性检测实验
    3.5 本章小结
第4章 FBA蛋白和GAPDH蛋白的融合表达
    4.1 前言
    4.2 实验材料
    4.3 实验方法
        4.3.1 FBA-GAP融合蛋白表达菌株的构建
        4.3.2 FBA-GAP融合蛋白的诱导表达及纯化
        4.3.3 FBA-GAP融合蛋白的Western blotting检测
    4.4 实验结果
        4.4.1 FBA-GAP串联蛋白表达菌株的构建
        4.4.2 FBA-GAP融合蛋白的诱导表达及纯化
    4.5 本章小结
第5章 结论与展望
    5.1 结论
    5.2 展望
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]甲醇营养型重组毕赤酵母高效表达外源蛋白过程的控制与优化(英文)[J]. 高敏杰,史仲平.  Chinese Journal of Chemical Engineering. 2013(02)
[2]巴氏毕赤酵母表达系统的研究进展[J]. 姚晶,吴正钧,任婧.  江苏农业科学. 2012(03)
[3]猪囊尾蚴磷蛋白在毕赤酵母中的表达及初步应用[J]. 苏彩霞,才学鹏,韩雪清,骆学农,郑亚东,窦永喜.  生物工程学报. 2003(04)
[4]迟缓爱德华氏菌胞外产物的细胞毒性和动物致病性[J]. 葛艳,陈怀青,陆承平.  中国兽医学报. 2000(01)



本文编号：3149758