大菱鲆TOLL样受体3（TLR3）基因克隆与诱导表达分析

发布时间：2021-04-22 15:44

　　大菱鲆（Scophthalmus maximus）是中国北方沿海区域一种广泛养殖的海水鱼类品种。近年来，随着人工养殖的快速发展，遭受了多种病害，尤其是像大菱鲆虹彩病病毒（TRBIV）所引发的病毒类疾病，使我国的大菱鲆人工养殖业遭受了巨大的经济损失。Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）是一种重要的模式识别受体（Pattern Recognition Reportor PRR）,是宿主抵抗病原体感染的Ⅰ型跨膜受体。它包含两个重要的结构域，细胞外富含亮氨酸重复（LRR）结构域和细胞内TIR （Toll/IL-1reporter）结构域，它们被一个跨膜区（transmembrane TM）所连接。在脊椎动物和无脊椎动物中，TLRs都能通过其LRR结构域识别外来或内源的病原相关分子模式（pathogen associated molecular pattern, PAMP）,借助TIR结构域激发髓样分化因子88（MyD88）依赖性途径或者是MyD88非依赖性途径，最终释放炎症细胞因子、Ⅰ型干扰素（IFN）以及趋化因子，引发天然免疫反应以及获得性免疫反应。TLR3是TL... 

【文章来源】：中国海洋大学山东省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 文献综述
    1 TOLL 样受体的研究进展
        1.1 TOLL 样受体的发现及研究
            1.1.1 鱼类 TLR 的发现及研究
        1.2 TOLL 样受体的结构和功能
        1.3 TOLL 样受体的的分布
        1.4 TOLL 样受体的的分类
        1.5 TLR 家族成员简介
            1.5.1 TLR2
            1.5.2 TLR3
            1.5.3 TLR4
            1.5.4 TLR5
            1.5.5 TLR9
            1.5.6 TLR1、TLR6 和 TLR10
        1.6 TLR 的信号转导机制
            1.6.1 MyD88 依赖性信号途径
            1.6.2 MyD88 非依赖性信号途径
            1.6.3 鱼类的信号转导途径
    2 本项研究的目的与意义
第二章 大菱鲆 TLR3 基因的克隆和序列分析
    1 实验材料
        1.1 实验鱼、菌株及质粒载体
        1.2 主要仪器与设备
        1.3 主要试剂及溶液配制
            1.3.1 主要试剂
            1.3.2 溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 大菱鲆组织的获取
        2.2 总 RNA 的提取及质量检测
        2.3 cDNA 第一链的合成
        2.4 大菱鲆 TLR3 全长 cDNA 克隆
            2.4.1 核心片段的克隆及测序
                2.4.1.1 简拼引物的设计
                2.4.1.2 核心片段 PCR 反应
                2.4.1.3 电泳检测
                2.4.1.4 PCR 产物的回收
                2.4.1.5 胶回收的 DNA 片段与载体的连接
                2.4.1.6 感受态细胞的制备
                2.4.1.7 连接产物的转化
                2.4.1.8 阳性克隆的鉴定
                2.4.1.9 核心片段序列分析
            2.4.2 3’-RACE 和 5’-RACE 片段的克隆及测序
                2.4.2.1 引物设计
                2.4.2.2 3’-RACE 片段的克隆及测序
                2.4.2.3 5’-RACE 片段的克隆及测序
            2.4.3 全长 cDNA 序列的拼接
        2.5 大菱鲆 TLR3 基因组 DNA 的克隆
            2.5.1 引物设计
            2.5.2 大菱鲆基因组 DNA 的提取
            2.5.3 基因组 DNA 的克隆以及测序
        2.6 序列结构分析与进化树的构建
    3 结果分析
        3.1 RNA 样品提取与质量检测
        3.2 核心片段克隆及测序结果
        3.3 3’-RACE 片段克隆及测序结果
        3.4 5’-RACE 片段克隆及测序结果
        3.5 全长 cDNA 序列拼接及分析
        3.6 SmTLR3 cDNA 序列的分子特征
        3.7 SmTLR3 基因组 DNA 克隆及基因结构特征
        3.8 SmTLR3 基因组的启动子结构特征
        3.9 SmTLR3 系统进化的分析
    4 讨论
第三章 大菱鲆 TLR3 mRNAs的组织分布研究
    1 实验材料
        1.1 实验动物
        1.2 主要仪器和设备
        1.3 主要的试剂和溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 大菱鲆的解剖和组织的获取
        2.2 总 RNA 提取和质量检测
        2.3 cDNA 第一链的合成
        2.4 引物设计
        2.5 qPCR 扩增与检测
    3 结果分析
    4 讨论
第四章 大菱鲆 TLR3 基因应对大菱鲆红体病病毒（TRBIV）和 PolyI:C刺激的表达分析
    1 实验材料
        1.1 实验动物和刺激物
        1.2 主要仪器与设备
        1.3 主要的试剂和溶液的配制
    2 实验方法
        2.1 TRBIV 及 PolyI:C 对大菱鲆鱼体的感染
        2.2 模板的制备
        2.3 qPCR 检测和分析
    3 结果分析
    4 讨论
结论
参考文献
致谢
个人简历
学术论文


【参考文献】：
期刊论文
[1]Toll样受体介导的先天性抗病毒免疫反应研究进展[J]. 何小兵,房永祥,贾怀杰,陈国华,曾爽,瞿惠玲,景志忠.  细胞与分子免疫学杂志. 2011(06)



本文编号：3154036