抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体的制备及初步应用
发布时间：2021-04-27 01:49
鱼源无乳链球菌（Streptococcus agalactiae）是一种具有高毒力的革兰氏阳性菌,能感染多种淡水和海水鱼类,每年给世界水产养殖业带来数以亿计的损失,近几年在我国南方罗非鱼养殖区肆虐流行,严重阻碍了我国罗非鱼养殖业的发展。鉴于单克隆抗体具有高度的特异性和灵敏性等优点,在病原检测方面有着突出的优势,本研究制备了抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体,并利用所生产的的单抗建立的夹心ELISA方法,如下:1.以罗非鱼源无乳链球菌GD09株灭活全菌抗原作为免疫原免疫6—8周龄的BALB/c小鼠,免疫3-4次并在效价达到1:12800以上时进行细胞融合,用建立的间接ELISA法进行筛选,制备了 9株抗罗非鱼源无乳链球菌全菌抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为4C12、4B5、3A9、3A10、3A12、3C5、1F1、4D12、3D2。经鉴定9株杂交瘤细胞染色体计数为90～110条,均大于亲本细胞,亚类鉴定结果显示4C12、3A10属于IgG2a亚类,4B5、4D12 属于 IgG1 亚类,3A9、3C5、1F1、3A12、3D2 属于 IgM 亚类;经测定 9 株单抗 4C12、4B5...
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
1.1 无乳链球菌概述
1.2 无乳链球菌的危害
1.3 无乳链球菌的诊断方法
1.3.1 PCR
1.3.2 LAMP
1.3.3 生化试验
1.3.4 荧光原位杂交（FISH）
1.4 无乳链球菌表面蛋白
1.4.1 C抗原
1.4.2 Alp蛋白家族
1.4.3 β蛋白
1.4.4 HvgA
1.4.5 富含丝氨酸重复蛋白（SRR）
1.4.6 Sip蛋白
1.4.7 Spb1蛋白
1.5 链球菌毒力因子
1.5.1 CpsY和CpsD
1.5.2 M-like protein
1.5.3 C5a肽酶
1.5.4 其它毒力因子
1.6 罗非鱼自身抗性与免疫治疗
1.7 链球菌单克隆抗体的研究现状
1.8 本研究的目的意义
第二章 罗非鱼无乳链球菌的分离纯化鉴定及保存
2.1 材料与方法
2.1.1 病料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 培养基及常用溶液配制
2.1.4 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 病原菌分离培养
2.2.2 形态特征鉴定
2.2.3 生理生化特性鉴定
2.2.4 PCR鉴定
2.2.5 动物回归试验
2.3 结果
2.3.1 病原菌分离培养
2.3.2 形态特征鉴定
2.3.3 生理生化特性鉴定
2.3.4 PCR鉴定
2.3.5 动物回归试验结果
2.4 讨论
第三章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体的制备
3.1 材料
3.1.1 实验动物及细胞株
3.1.2 细菌来源
3.1.3 主要试剂
3.1.4 仪器设备及耗材
3.1.5 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 罗非鱼无乳链球菌全菌抗原的制备
3.2.2 抗原浓度的测定（麦氏比浊法）
3.2.3 动物免疫
3.2.4 间接ELISA方法的建立
3.2.5 小鼠血清效价测定
3.2.6 细胞融合
3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选
3.2.8 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏
3.2.10 单克隆抗体的制备
3.3 结果
3.3.1 间接ELISA方法的建立
3.3.2 免疫小鼠血清效价的测定结果
3.3.3 细胞融合
3.4 讨论
3.4.1 抗原的选择
3.4.2 动物免疫
3.4.3 间接ELISA方法的建立
3.4.4 细胞融合
第四章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体生物学特性的鉴定
4.1 材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 试验用试剂配制
4.1.3 主要仪器设备及耗材
4.2 方法
4.2.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定
4.2.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析
4.2.3 单抗亚类的鉴定
4.2.4 单抗重链、轻链验证
4.2.5 单抗相对亲和力的测定
4.2.6 单抗的抗原结合位点鉴定
4.2.7 单抗杂交瘤细胞的稳定性
4.3 结果
4.3.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定
4.3.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析
4.3.3 单克隆抗体亚类的鉴定
4.3.4 单克隆抗体重链、轻链分子质量测定
4.3.5 单克隆抗体相对亲和力的测定
4.3.6 单克隆抗体识别抗原表位鉴定结果
4.3.7 单克隆抗体杂交瘤细胞的稳定性鉴定
4.4 讨论
第五章 双抗体夹心ELISA法的建立与初步应用
5.1 材料
5.1.1 罗非鱼阴性阳性样品
5.1.2 主要试剂
5.1.3 试剂的配制
5.1.4 主要仪器及耗材
5.2 方法
5.2.1 正辛酸—饱和硫酸铵法纯化腹水单抗
5.2.2 蛋白G亲和层析法纯化单克隆抗体
5.2.3 HRP标记腹水单抗
5.2.4 酶标抗体活性的鉴定
5.2.5 酶量、IgG量、酶标记率和克分子比的测定
5.2.6 双抗体夹心ELISA法的初步建立
5.2.7 实验感染样本的检测
5.3 结果与分析
5.3.1 腹水单抗的正辛酸—饱和硫酸铵法纯化
5.3.2 腹水单抗初提及亲和层析纯化结果
5.3.3 腹水单抗标记结果
5.3.4 酶标抗体的活性的确定
5.3.5 单抗最佳包被浓度及酶标抗体最佳稀释度的确定
5.3.6 夹心ELISA方法的条件优化
5.3.7 双抗体夹心ELISA法检测阴阳性抗原临界值的确定
5.3.8 敏感性实验
5.3.9 特异性实验
5.3.10 双抗体夹心ELISA法检测感染鱼不同组织样品浸出液中链球菌的结果
5.4 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
申明
本文编号：3162530
【文章来源】：广西大学广西壮族自治区 211工程院校
【文章页数】：80 页
【学位级别】：硕士
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摘要
ABSTRACT
符号说明
第一章 文献综述
1.1 无乳链球菌概述
1.2 无乳链球菌的危害
1.3 无乳链球菌的诊断方法
1.3.1 PCR
1.3.2 LAMP
1.3.3 生化试验
1.3.4 荧光原位杂交（FISH）
1.4 无乳链球菌表面蛋白
1.4.1 C抗原
1.4.2 Alp蛋白家族
1.4.3 β蛋白
1.4.4 HvgA
1.4.5 富含丝氨酸重复蛋白（SRR）
1.4.6 Sip蛋白
1.4.7 Spb1蛋白
1.5 链球菌毒力因子
1.5.1 CpsY和CpsD
1.5.2 M-like protein
1.5.3 C5a肽酶
1.5.4 其它毒力因子
1.6 罗非鱼自身抗性与免疫治疗
1.7 链球菌单克隆抗体的研究现状
1.8 本研究的目的意义
第二章 罗非鱼无乳链球菌的分离纯化鉴定及保存
2.1 材料与方法
2.1.1 病料
2.1.2 主要试剂
2.1.3 培养基及常用溶液配制
2.1.4 仪器和设备
2.2 实验方法
2.2.1 病原菌分离培养
2.2.2 形态特征鉴定
2.2.3 生理生化特性鉴定
2.2.4 PCR鉴定
2.2.5 动物回归试验
2.3 结果
2.3.1 病原菌分离培养
2.3.2 形态特征鉴定
2.3.3 生理生化特性鉴定
2.3.4 PCR鉴定
2.3.5 动物回归试验结果
2.4 讨论
第三章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体的制备
3.1 材料
3.1.1 实验动物及细胞株
3.1.2 细菌来源
3.1.3 主要试剂
3.1.4 仪器设备及耗材
3.1.5 试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 罗非鱼无乳链球菌全菌抗原的制备
3.2.2 抗原浓度的测定（麦氏比浊法）
3.2.3 动物免疫
3.2.4 间接ELISA方法的建立
3.2.5 小鼠血清效价测定
3.2.6 细胞融合
3.2.7 阳性杂交瘤细胞的筛选
3.2.8 阳性杂交瘤细胞的克隆化培养
3.2.9 杂交瘤细胞的冻存与复苏
3.2.10 单克隆抗体的制备
3.3 结果
3.3.1 间接ELISA方法的建立
3.3.2 免疫小鼠血清效价的测定结果
3.3.3 细胞融合
3.4 讨论
3.4.1 抗原的选择
3.4.2 动物免疫
3.4.3 间接ELISA方法的建立
3.4.4 细胞融合
第四章 抗罗非鱼源无乳链球菌单克隆抗体生物学特性的鉴定
4.1 材料
4.1.1 主要试剂
4.1.2 试验用试剂配制
4.1.3 主要仪器设备及耗材
4.2 方法
4.2.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定
4.2.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析
4.2.3 单抗亚类的鉴定
4.2.4 单抗重链、轻链验证
4.2.5 单抗相对亲和力的测定
4.2.6 单抗的抗原结合位点鉴定
4.2.7 单抗杂交瘤细胞的稳定性
4.3 结果
4.3.1 单抗杂交瘤细胞培养上清及部分杂交瘤株小鼠腹水效价的测定
4.3.2 单抗杂交瘤细胞的染色体分析
4.3.3 单克隆抗体亚类的鉴定
4.3.4 单克隆抗体重链、轻链分子质量测定
4.3.5 单克隆抗体相对亲和力的测定
4.3.6 单克隆抗体识别抗原表位鉴定结果
4.3.7 单克隆抗体杂交瘤细胞的稳定性鉴定
4.4 讨论
第五章 双抗体夹心ELISA法的建立与初步应用
5.1 材料
5.1.1 罗非鱼阴性阳性样品
5.1.2 主要试剂
5.1.3 试剂的配制
5.1.4 主要仪器及耗材
5.2 方法
5.2.1 正辛酸—饱和硫酸铵法纯化腹水单抗
5.2.2 蛋白G亲和层析法纯化单克隆抗体
5.2.3 HRP标记腹水单抗
5.2.4 酶标抗体活性的鉴定
5.2.5 酶量、IgG量、酶标记率和克分子比的测定
5.2.6 双抗体夹心ELISA法的初步建立
5.2.7 实验感染样本的检测
5.3 结果与分析
5.3.1 腹水单抗的正辛酸—饱和硫酸铵法纯化
5.3.2 腹水单抗初提及亲和层析纯化结果
5.3.3 腹水单抗标记结果
5.3.4 酶标抗体的活性的确定
5.3.5 单抗最佳包被浓度及酶标抗体最佳稀释度的确定
5.3.6 夹心ELISA方法的条件优化
5.3.7 双抗体夹心ELISA法检测阴阳性抗原临界值的确定
5.3.8 敏感性实验
5.3.9 特异性实验
5.3.10 双抗体夹心ELISA法检测感染鱼不同组织样品浸出液中链球菌的结果
5.4 讨论
第六章 结论
参考文献
致谢
攻读学位期间发表的学术论文
申明
本文编号：3162530
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