三角帆蚌外套膜组织外泌体对贝壳珍珠层颜色的影响

发布时间：2021-05-10 00:45

　　我国淡水珍珠产量自上世纪80年代初以来一直处于世界领先地位,三角帆蚌（Hypriosis20cumingii）是最主要育珠蚌。三角帆蚌所产珍珠珠质光滑细腻,颜色鲜艳多样。珍珠颜色影响珍珠价值。珍珠颜色受到供片蚌珍珠层颜色的影响。外泌体参与贝壳形成,外泌体是否参与贝壳珍珠层颜色形成值得关注。本研究以实验室构建的三角帆蚌紫色（贝壳珍珠层为紫色）与白色（贝壳珍珠层为白色）家系为实验材料,通过miRNA与蛋白质组测序技术对外套膜外泌体在贝壳珍珠层颜色形成过程中的作用进行了研究。主要结果如下:1.三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体提取、鉴定及miRNA表达谱分析首次成功提取三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体。使用电镜鉴定外泌体形态为茶托样,粒径分布分析表明白色与紫色家系外泌体直径分别为175.2±5.120nm及176.1±5.4nm。对两种外泌体small20RNA文库进行高通量测序与表达谱分析。通过与miRbase20V21数据库比对,在白色与紫色家系外套膜外泌体中分别获得了136个与159个miRNA。使用|log2（Fold20change）|≥2,且20p20value≤0.0520的... 

【文章来源】：上海海洋大学上海市

【文章页数】：110 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
引言
第一章 文献综述
    1. 贝壳的形成与结构
    2. 珍珠层颜色研究进展
        2.1 金属元素致色
        2.2 有机物致色
        2.3 珍珠层结构致色
    3. 外泌体研究进展
    4. 本研究的目的与意义
第二章 三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体的提取、鉴定及miRNA表达谱分析
    第一节 不同壳色三角帆蚌外套膜外泌的提取、鉴定
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 外套膜组织外泌体的提取
                1.2.2 外泌体的电镜鉴定(TEM)
                1.2.3 外泌体的纳米颗粒追踪分析检测(NTA)
        2 结果
            2.1 外泌体电镜观察与粒径分布
        3 讨论
    第二节 不同壳色三角帆蚌外套膜外泌的miRNA表达谱分析
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 总RNA的提取
                1.2.2 两种壳色三角帆蚌外套膜外泌体miRNA文库构建与测序
                1.2.3 差异表达miRNA的qPCR验证
        2 结果
            2.1 不同壳色三角帆蚌外套膜外泌体miRNA测序质量分析
            2.2 差异表达miRNAs分析及qPCR验证
        3 讨论
第三章 外泌体miRNA对三角帆蚌珍珠层颜色形成相关基因的调控作用
    第一节 miR-15b调控三角帆蚌hcApo基因
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 双荧光素酶报告载体构建
                1.2.2 293T细胞的培养及转染
                1.2.3 双荧光素酶报告基因检测
                1.2.4 三角帆蚌中miR-15b的抑制
                1.2.5 miR-15b的组织表达
                1.2.6 hcApo基因的组织定量分析
        2 结果
            2.1 双荧光素酶报告基因检测分析
            2.2 miR-15b与hcApo基因的组织表达分析
        3 讨论
    第二节 miR-4504调控三角帆蚌HcMitf基因
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 双荧光素酶报告载体构建
                1.2.2 293T 细胞的培养与转染
                1.2.3 双荧光素酶报告基因检测
                1.2.4 三角帆蚌中miR-4504的抑制
                1.2.5 miR-4504的组织表达
                1.2.6 HcMitf与HcTyr基因的组织定量分析
                1.2.7 外套膜组织酪氨酸酶活性检测
                1.2.8 外套膜组织黑色素含量检测
                1.2.9 数据统计与分析
        2 结果
            2.1 双荧光素酶报告基因检测分析
            2.2 miR-4504、HcMitf及其下游基因HcTyr的组织表达分析
            2.3 外套膜组织酪氨酸酶活性与黑色素含量
        3 讨论
第四章 三角帆蚌白色与紫色家系外套膜外泌体蛋白组学分析
    1 材料与方法
        1.1 实验材料
        1.2 实验方法
            1.2.1 外套膜组织外泌体提取
            1.2.2 外泌体电镜鉴定与纳米颗粒追踪分析
            1.2.3 外泌体总蛋白提取
            1.2.4 TMT标记
            1.2.5 高效液相色谱分级
            1.2.6 液相色谱-串联质谱分析
            1.2.7 质谱数据分析
            1.2.8 生物信息学分析
            1.2.9 通过PRM验证差异表达蛋白
    2 结果
        2.1 外套膜外泌体的鉴定
        2.2 蛋白质谱与功能注释
        2.3 差异蛋白鉴定与富集分析
        2.4 差异表达蛋白的PRM验证
    3 讨论
第五章 三角帆蚌珍珠层颜色形成相关基因的克隆与表达分析
    第一节 三角帆蚌铁蛋白基因HcFerritin的克隆与表达分析
        1 材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 总RNA提取以及HcFerritin基因克隆
                1.2.2 HcFerritin基因序列分析
                1.2.3 HcFerritin基因组织特异性表达分析
                1.2.4 原位杂交
                1.2.5 铁胁迫对HcFerritin基因的表达分析
        2 结果
            2.1 HcFerritin基因的克隆与序列分析
            2.2 系统发育分析
            2.3 HcFerritin基因的组织表达分析
            2.4 原位杂交结果
            2.5 铁胁迫后HcFerritin基因的表达分析
        3 讨论
    第二节 三角帆蚌粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因HcCPOX的克隆与表达分析
        1 实验材料与方法
            1.1 实验材料
            1.2 实验方法
                1.2.1 总RNA提取以及HcCPOX基因克隆
                1.2.2 HcCPOX基因序列分析
                1.2.3 HcCPOX基因组织特异性表达分析
                1.2.4 原位杂交
                1.2.5 组织粪卟啉原Ⅲ氧化酶活性检测
                1.2.6 RNA干扰
        2 结果
            2.1 HcCPOX基因的克隆与序列分析
            2.2 系统发育分析
            2.3 HcCPOX基因的组织表达分析
            2.4 原位杂交
            2.5 组织粪卟啉原Ⅲ氧化酶活性检测
            2.6 RNA干扰后检测
        3 讨论
结论
参考文献
附录
博士期间科研成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]三角帆蚌所育不同颜色珍珠及其相关组织金属元素种类和含量差异分析[J]. 姜琦,白志毅,孙朝虎.  上海海洋大学学报. 2019(06)
[2]三角帆蚌hcSRCR1基因的克隆及在不同壳色选育系中的表达模式[J]. 李西雷,李卿青,任名栋,白志毅,李家乐.  水产学报. 2018(11)
[3]马氏珠母贝（Pinctada20fucata20martensii）PmHEX基因的功能研究[J]. 范闪闪,郑哲,郝瑞娟,王庆恒,杜晓东.  基因组学与应用生物学. 2019(01)
[4]文蛤粪卟啉原Ⅲ氧化酶基因克隆及与壳色性状的相关性分析[J]. 詹艳玲,董迎辉,何琳,阮文斌,高晓艳,林志华.  水产学报. 2017(07)
[5]栉孔扇贝几丁质酶基因的克隆及功能鉴定[J]. 王俊,高静,谢军,郑向南,谢莉萍,张荣庆.  水产学报. 2017(02)
[6]三角帆蚌EF-hand基因的表达研究[J]. 祁晓翔,李文娟,施志仪,尚朝,周子睿,尚攀.  浙江农业学报. 2015(12)
[7]4种壳色合浦珠母贝贝壳棱柱层和珍珠质层7种金属元素质量分数的比较分析[J]. 邹柯姝,张殿昌,郭华阳,张楠,江世贵.  南方水产科学. 2015(03)
[8]Exosome20and20Exosomal20MicroRNA:20Trafficking,20Sorting,20and20Function[J]. Jian Zhang,Sha Li,Lu Li,Meng Li,Chongye Guo,Jun Yao,Shuangli Mi.  Genomics,Proteomics & Bioinformatics. 2015(01)
[9]不同颜色的淡水养殖珍珠呈色机理研究[J]. 严俊,胡仙超,王巨安,严雪俊,胡丹静,刘培钧,方诗彬.  岩矿测试. 2013(02)
[10]卟啉的生物合成途径与化学合成方法的比较[J]. 苏优拉,张逸,李嘉宾,陆军农.  大学化学. 2012(06)

博士论文
[1]人类卟啉症及贫血的斑马鱼疾病模型的建立与解析[D]. 张淑青.苏州大学 2015
[2]铁蛋白在虾夷扇贝新品种“海大金贝”高抗逆性中的作用及机理研究[D]. 张月月.中国海洋大学 2013
[3]珍珠层的微结构及其中类胡萝卜素的原位研究[D]. 张刚生.中国科学院广州地球化学研究所 2001

硕士论文
[1]三角帆蚌碳酸酐酶基因与珍珠颜色和珍珠形成相关初步研究[D]. 王芹.上海海洋大学 2017
[2]三角帆蚌酪氨酸酶相关基因克隆及对珍珠层颜色影响研究[D]. 陈夏君.上海海洋大学 2017
[3]三角帆蚌供片蚌对珍珠质量的影响[D]. 刘越.上海海洋大学 2013
[4]虾青素对马氏珠母贝的影响研究[D]. 马孝甜.广东海洋大学 2012
[5]三角帆蚌两种贝壳珍珠质颜色对珍珠颜色影响的研究[D]. 朱文彬.上海海洋大学 2011
[6]卟啉及金属卟啉对珍珠颜色的贡献及致色机理研究[D]. 张蕴韬.中国地质大学（北京） 2006



本文编号：3178343