罗非鱼CD6分子及其相关配体的鉴定与功能研究
发布时间：2021-05-12 16:12
哺乳动物中,CD6分子作为来自清道夫受体家族的一种淋巴细胞特异性表面受体,在抗炎症反应以及T细胞激活中具有重要作用,兼顾先天性免疫和适应性免疫调控。但是,CD6分子在以硬骨鱼类为代表的低等脊椎动物中的特性和功能尚不清楚。为探究鱼类CD6分子功能,本论文以尼罗罗非鱼为对象克隆鉴定了CD6分子（On CD6）及其配体CD166、Syntenin-1、LCP2和TARF6。由此展开了以下4个方面的工作:（1）通过原核表达获取了On CD6胞外段蛋白,制备单克隆抗体,探究了On CD6分子富含半胱氨酸结构域胞外段蛋白的生物学功能;（2）以罗非鱼头肾淋巴细胞和动物实验探究了On CD6分子参与炎症反应的作用机制;（3）通过GST Pull-Down确定了On CD6分子与其配体的互作及互作结构域（4）初步探究了On CD6分子及其配体参与的信号通路。取得的研究结果如下:1、On CD6分子作为清道夫受体具备模式识别受体的功能本研究成功克隆鉴定了罗非鱼CD6基因,该分子定位于淋巴细胞膜上。体外实验表明On CD6分子胞外段重组蛋白On CD6-ECD在Ca2+作用下能够广泛识...
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 免疫应答机制概述
1.1.1 先天性免疫
1.1.2 适应性免疫
1.1.3 T细胞激活机制
1.2 清道夫受体概述
1.2.1 清道夫受体家族分类
1.2.2 清道夫受体家族功能
1.3 CD6的研究进展
1.3.1 CD6分子结构特征
1.3.2 CD6分子生理功能
1.3.3 CD6分子配体概述
1.4 研究目的和意义
2 OnCD6分子的克隆和表达特征分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验用鱼
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 实验引物
2.3 实验方法
2.3.1 实验用鱼及预处理
2.3.2 总RNA提取和c DNA合成
2.3.3 OnCD6基因克隆
2.3.4 OnCD6生物信息学分析
2.3.5 OnCD6实时荧光定量
2.3.6 OnCD6胞外段原核表达
2.3.7 OnCD6单克隆抗体制备方法
2.3.8 OnCD6亚细胞定位实验
2.4 实验结果
2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息学分析
2.4.2 OnCD6的组织分布
2.4.3 OnCD6在无乳链球菌刺激后的表达模式
2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表达模式
2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表达模式
2.4.6 OnCD6胞外段的原核表达及纯化
2.4.7 OnCD6的单克隆抗体制备
2.4.8 OnCD6的亚细胞定位
2.5 实验讨论
3 OnCD6体外功能验证
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验细菌
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 实验引物
3.3 实验方法
3.3.1 OnCD6-ECD与细菌结合检测
3.3.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合检测
3.3.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集检测
3.3.4 OnCD6-ECD体外抑菌实验
3.3.5 OnCD6-ECD参与吞噬反应检测
3.3.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发影响的实验
3.3.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达影响的实验
3.3.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖影响的实验
3.4 实验结果
3.4.1 OnCD6-ECD参与结合细菌
3.4.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合
3.4.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集反应
3.4.4 OnCD6-ECD具有体外抑菌活性
3.4.5 OnCD6-ECD促进HKLs对细菌吞噬
3.4.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发的影响
3.4.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达的影响
3.4.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖的影响
3.5 实验讨论
4 OnCD6体内功能探究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验用鱼
4.2.2 实验病菌
4.2.3 实验试剂
4.2.4 实验设备
4.2.5 实验引物
4.3 实验方法
4.3.1 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼存活率影响实验
4.3.2 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼载菌量的检测
4.3.3 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼病理生化指标的影响实验
4.3.4 CD6体内过表达的生物学效应探究实验
4.3.5 HE染色
4.3.6 生化指标检测
4.3.7 通路抑制剂孵育HKLs检测信号通路
4.4 实验结果
4.4.1 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼生存率的影响
4.4.2 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼载菌量影响
4.4.3 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼病理变化的影响
4.4.4 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼外周血生化指标的影响
4.4.5 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼炎症因子表达的影响
4.4.6 OnCD6体内过表达验证结果
4.4.7 OnCD6体内过表达对无乳链球菌感染罗非鱼存活率的影响
4.4.8 OnCD6体内过表达对炎症因子表达的影响
4.4.9 OnCD6在HKLs中信号通路检测
4.5 实验讨论
5 CD6与胞外配体CD166的相互作用探究
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 实验用鱼
5.2.2 实验细菌
5.2.3 实验试剂
5.2.4 实验仪器
5.2.5 实验引物
5.3 实验方法
5.3.1 实验用鱼及预处理
5.3.2 总RNA提取和c DNA合成
5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析
5.3.4 OnCD166荧光定量
5.3.5 OnCD166胞外段原核表达
5.3.6 OnCD166多克隆抗体的制备实验
5.3.7 OnCD166-ECD与细菌结合检测
5.3.8 OnCD166-ECD与 PAMPs结合检测
5.3.9 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应检测
5.3.10 GST Pull-Down验证OnCD166和OnCD6 相互作用
5.3.11 OnCD166亚细胞定位及共定位实验
5.4 实验结果
5.4.1 OnCD166基因克隆与生信分析
5.4.2 OnCD166 m RNA表达特征
5.4.3 OnCD166-ECD原核表达
5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗体制备
5.4.5 OnCD166-ECD参与细菌结合
5.4.6 OnCD166-ECD与 PAMPs结合
5.4.7 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应
5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用结构域确定
5.4.9 OnCD166 亚细胞定位及与OnCD6 共定位
5.5 实验讨论
6 CD6与胞内配体的互作及信号通路初探
6.1 引言
6.2 实验材料
6.2.1 实验用鱼
6.2.2 实验试剂
6.2.3 实验仪器
6.2.4 实验引物
6.3 实验方法
6.3.1 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析
6.3.2 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 荧光定量
6.3.3 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表达
6.3.4 抗体封闭实验
6.3.5 GSTPull-Down验证OnCD6与Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作
6.3.6 双荧光素酶报告基因检测实验
6.4 实验结果
6.4.1 罗非鱼Syntenin-1 基因克隆及生信分析
6.4.2 罗非鱼LCP2基因克隆和生信分析
6.4.3 罗非鱼TRAF6基因克隆和生信分析
6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表达特征
6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表达及纯化
6.4.6 抗体封闭实验结果
6.4.7 OnCD6-ICD与 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作
6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 参与的信号通路
6.5 实验讨论
7 全文总结与展望
7.1 全文总结
7.2 后续展望
参考文献
附录Ⅰ GST标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性
附录Ⅱ His标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类免疫应答机制研究进展[J]. 白姗姗,贾智英,石连玉. 水产学杂志. 2017(04)
[2]罗非鱼免疫学研究进展[J]. 甘桢,王蓓,鲁义善,汤菊芬,简纪常,吴灶和. 生物技术通报. 2014(11)
[3]无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的克隆及原核表达[J]. 王培,鲁义善,王蓓,汤菊芬,蔡佳,吴灶和,简纪常. 生物技术通报. 2014(02)
[4]PDZ结构域的结构特点及其识别特异性配体的机制[J]. 李华,林葵,吴更. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(12)
[5]鱼类免疫学研究进展[J]. 唐玫,马广智,徐军. 免疫学杂志. 2002(S1)
[6]CD6分子的研究进展[J]. 扈凤平,韦超凡. 国外医学(免疫学分册). 1999(04)
[7]鱼类非特异性免疫研究的新进展[J]. 聂品. 水产学报. 1997(01)
[8]中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[J]. 何海琪,孙凤. 海洋与湖沼. 1992(05)
博士论文
[1]罗非鱼NCC活性调控蛋白及效应因子的鉴定与功能分析[D]. 黄瑜.广东海洋大学 2018
[2]草鱼热激蛋白70（HSP70）的细胞因子功能及参与炎症反应调节的研究[D]. 张安英.电子科技大学 2018
[3]感染无乳链球菌尼罗罗非鱼脾脏的病理学研究[D]. 贺扬.四川农业大学 2017
[4]牙鲆免疫相关基因及热休克蛋白基因的转录表达[D]. 黄琳.中国科学院研究生院(海洋研究所) 2015
[5]草鱼白细胞介素1β诱导表达的负调控机制及其在炎症反应中的意义[D]. 杨潇.电子科技大学 2014
[6]罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究[D]. 黄锦炉.四川农业大学 2012
[7]河豚清道夫受体的基因鉴定及其在炎症反应中的功能研究[D]. 孟真.浙江大学 2011
[8]鱼类Th细胞标志分子的克隆与功能研究及Th细胞的初步鉴定[D]. 巩永凤.浙江大学 2009
[9]HAb18G/CD147分子调控T细胞活化与免疫突触形成[D]. 胡劲松.第四军医大学 2008
[10]应激对黄颡鱼非特异性免疫细胞的影响[D]. 刘小玲.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]无乳链球菌和海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果[D]. 付天增.山东农业大学 2017
[2]尼罗罗非鱼T细胞激活相关基因的功能研究[D]. 甘桢.广东海洋大学 2015
[3]棕点石斑鱼中草药免疫增强剂的筛选及其非特异性免疫增强效果研究[D]. 孙晓飞.海南大学 2014
[4]SAMHD1单克隆抗体的制备及其初步应用[D]. 戈曼.东北农业大学 2013
[5]红笛鲷重组激活基因克隆及表达分析[D]. 张雪利.广东海洋大学 2012
[6]对虾肠道益生菌的筛选与免疫物质活性评价指标的建立[D]. 李海兵.中国海洋大学 2008
本文编号：3183720
【文章来源】：广东海洋大学广东省
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
1 文献综述
1.1 免疫应答机制概述
1.1.1 先天性免疫
1.1.2 适应性免疫
1.1.3 T细胞激活机制
1.2 清道夫受体概述
1.2.1 清道夫受体家族分类
1.2.2 清道夫受体家族功能
1.3 CD6的研究进展
1.3.1 CD6分子结构特征
1.3.2 CD6分子生理功能
1.3.3 CD6分子配体概述
1.4 研究目的和意义
2 OnCD6分子的克隆和表达特征分析
2.1 引言
2.2 实验材料
2.2.1 实验用鱼
2.2.2 实验试剂
2.2.3 实验仪器
2.2.4 实验引物
2.3 实验方法
2.3.1 实验用鱼及预处理
2.3.2 总RNA提取和c DNA合成
2.3.3 OnCD6基因克隆
2.3.4 OnCD6生物信息学分析
2.3.5 OnCD6实时荧光定量
2.3.6 OnCD6胞外段原核表达
2.3.7 OnCD6单克隆抗体制备方法
2.3.8 OnCD6亚细胞定位实验
2.4 实验结果
2.4.1 OnCD6的基因克隆和生物信息学分析
2.4.2 OnCD6的组织分布
2.4.3 OnCD6在无乳链球菌刺激后的表达模式
2.4.4 OnCD6 在不同刺激物刺激HKLs后的表达模式
2.4.5 OnCD6在KLH刺激后的表达模式
2.4.6 OnCD6胞外段的原核表达及纯化
2.4.7 OnCD6的单克隆抗体制备
2.4.8 OnCD6的亚细胞定位
2.5 实验讨论
3 OnCD6体外功能验证
3.1 引言
3.2 实验材料
3.2.1 实验细菌
3.2.2 实验试剂
3.2.3 实验仪器
3.2.4 实验引物
3.3 实验方法
3.3.1 OnCD6-ECD与细菌结合检测
3.3.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合检测
3.3.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集检测
3.3.4 OnCD6-ECD体外抑菌实验
3.3.5 OnCD6-ECD参与吞噬反应检测
3.3.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发影响的实验
3.3.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达影响的实验
3.3.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖影响的实验
3.4 实验结果
3.4.1 OnCD6-ECD参与结合细菌
3.4.2 OnCD6-ECD与 PAMPs结合
3.4.3 OnCD6-ECD诱导细菌凝集反应
3.4.4 OnCD6-ECD具有体外抑菌活性
3.4.5 OnCD6-ECD促进HKLs对细菌吞噬
3.4.6 OnCD6-ECD对 HKLs呼吸爆发的影响
3.4.7 OnCD6-ECD对 HKLs炎症因子表达的影响
3.4.8 OnCD6-ECD及其单克隆抗体对HKLs增殖的影响
3.5 实验讨论
4 OnCD6体内功能探究
4.1 引言
4.2 实验材料
4.2.1 实验用鱼
4.2.2 实验病菌
4.2.3 实验试剂
4.2.4 实验设备
4.2.5 实验引物
4.3 实验方法
4.3.1 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼存活率影响实验
4.3.2 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼载菌量的检测
4.3.3 OnCD6-ECD重组蛋白对感染无乳链球菌的罗非鱼病理生化指标的影响实验
4.3.4 CD6体内过表达的生物学效应探究实验
4.3.5 HE染色
4.3.6 生化指标检测
4.3.7 通路抑制剂孵育HKLs检测信号通路
4.4 实验结果
4.4.1 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼生存率的影响
4.4.2 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼载菌量影响
4.4.3 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼病理变化的影响
4.4.4 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼外周血生化指标的影响
4.4.5 OnCD6-ECD重组蛋白对无乳链球菌感染罗非鱼炎症因子表达的影响
4.4.6 OnCD6体内过表达验证结果
4.4.7 OnCD6体内过表达对无乳链球菌感染罗非鱼存活率的影响
4.4.8 OnCD6体内过表达对炎症因子表达的影响
4.4.9 OnCD6在HKLs中信号通路检测
4.5 实验讨论
5 CD6与胞外配体CD166的相互作用探究
5.1 引言
5.2 实验材料
5.2.1 实验用鱼
5.2.2 实验细菌
5.2.3 实验试剂
5.2.4 实验仪器
5.2.5 实验引物
5.3 实验方法
5.3.1 实验用鱼及预处理
5.3.2 总RNA提取和c DNA合成
5.3.3 OnCD166基因克隆和生信分析
5.3.4 OnCD166荧光定量
5.3.5 OnCD166胞外段原核表达
5.3.6 OnCD166多克隆抗体的制备实验
5.3.7 OnCD166-ECD与细菌结合检测
5.3.8 OnCD166-ECD与 PAMPs结合检测
5.3.9 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应检测
5.3.10 GST Pull-Down验证OnCD166和OnCD6 相互作用
5.3.11 OnCD166亚细胞定位及共定位实验
5.4 实验结果
5.4.1 OnCD166基因克隆与生信分析
5.4.2 OnCD166 m RNA表达特征
5.4.3 OnCD166-ECD原核表达
5.4.4 OnCD166-ECD多克隆抗体制备
5.4.5 OnCD166-ECD参与细菌结合
5.4.6 OnCD166-ECD与 PAMPs结合
5.4.7 OnCD166-ECD诱导细菌凝集反应
5.4.8 OnCD166-OnCD6 互作及相互作用结构域确定
5.4.9 OnCD166 亚细胞定位及与OnCD6 共定位
5.5 实验讨论
6 CD6与胞内配体的互作及信号通路初探
6.1 引言
6.2 实验材料
6.2.1 实验用鱼
6.2.2 实验试剂
6.2.3 实验仪器
6.2.4 实验引物
6.3 实验方法
6.3.1 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 基因克隆及生信分析
6.3.2 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 荧光定量
6.3.3 罗非鱼Syntenin-1、LCP2和TRAF6 原核表达
6.3.4 抗体封闭实验
6.3.5 GSTPull-Down验证OnCD6与Syntenin-1、LCP2和TRAF6 互作
6.3.6 双荧光素酶报告基因检测实验
6.4 实验结果
6.4.1 罗非鱼Syntenin-1 基因克隆及生信分析
6.4.2 罗非鱼LCP2基因克隆和生信分析
6.4.3 罗非鱼TRAF6基因克隆和生信分析
6.4.4 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 m RNA表达特征
6.4.5 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6原核表达及纯化
6.4.6 抗体封闭实验结果
6.4.7 OnCD6-ICD与 On Syntenin-1、On LCP2和On TRAF6 互作
6.4.8 OnCD6、OnCD166和On TRAF6 参与的信号通路
6.5 实验讨论
7 全文总结与展望
7.1 全文总结
7.2 后续展望
参考文献
附录Ⅰ GST标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性
附录Ⅱ His标签包涵体蛋白变性条件下表达、纯化和复性
致谢
作者简介
导师简介
【参考文献】：
期刊论文
[1]鱼类免疫应答机制研究进展[J]. 白姗姗,贾智英,石连玉. 水产学杂志. 2017(04)
[2]罗非鱼免疫学研究进展[J]. 甘桢,王蓓,鲁义善,汤菊芬,简纪常,吴灶和. 生物技术通报. 2014(11)
[3]无乳链球菌诱导吉富罗非鱼分泌型免疫球蛋白M（sIgM）重链基因的克隆及原核表达[J]. 王培,鲁义善,王蓓,汤菊芬,蔡佳,吴灶和,简纪常. 生物技术通报. 2014(02)
[4]PDZ结构域的结构特点及其识别特异性配体的机制[J]. 李华,林葵,吴更. 中国生物化学与分子生物学报. 2011(12)
[5]鱼类免疫学研究进展[J]. 唐玫,马广智,徐军. 免疫学杂志. 2002(S1)
[6]CD6分子的研究进展[J]. 扈凤平,韦超凡. 国外医学(免疫学分册). 1999(04)
[7]鱼类非特异性免疫研究的新进展[J]. 聂品. 水产学报. 1997(01)
[8]中国对虾酸性和碱性磷酸酶的特性研究[J]. 何海琪,孙凤. 海洋与湖沼. 1992(05)
博士论文
[1]罗非鱼NCC活性调控蛋白及效应因子的鉴定与功能分析[D]. 黄瑜.广东海洋大学 2018
[2]草鱼热激蛋白70（HSP70）的细胞因子功能及参与炎症反应调节的研究[D]. 张安英.电子科技大学 2018
[3]感染无乳链球菌尼罗罗非鱼脾脏的病理学研究[D]. 贺扬.四川农业大学 2017
[4]牙鲆免疫相关基因及热休克蛋白基因的转录表达[D]. 黄琳.中国科学院研究生院(海洋研究所) 2015
[5]草鱼白细胞介素1β诱导表达的负调控机制及其在炎症反应中的意义[D]. 杨潇.电子科技大学 2014
[6]罗非鱼无乳链球菌病病原学、病理学及cpsE基因的原核表达研究[D]. 黄锦炉.四川农业大学 2012
[7]河豚清道夫受体的基因鉴定及其在炎症反应中的功能研究[D]. 孟真.浙江大学 2011
[8]鱼类Th细胞标志分子的克隆与功能研究及Th细胞的初步鉴定[D]. 巩永凤.浙江大学 2009
[9]HAb18G/CD147分子调控T细胞活化与免疫突触形成[D]. 胡劲松.第四军医大学 2008
[10]应激对黄颡鱼非特异性免疫细胞的影响[D]. 刘小玲.华中农业大学 2006
硕士论文
[1]无乳链球菌和海豚链球菌灭活疫苗对罗非鱼的免疫效果[D]. 付天增.山东农业大学 2017
[2]尼罗罗非鱼T细胞激活相关基因的功能研究[D]. 甘桢.广东海洋大学 2015
[3]棕点石斑鱼中草药免疫增强剂的筛选及其非特异性免疫增强效果研究[D]. 孙晓飞.海南大学 2014
[4]SAMHD1单克隆抗体的制备及其初步应用[D]. 戈曼.东北农业大学 2013
[5]红笛鲷重组激活基因克隆及表达分析[D]. 张雪利.广东海洋大学 2012
[6]对虾肠道益生菌的筛选与免疫物质活性评价指标的建立[D]. 李海兵.中国海洋大学 2008
本文编号：3183720
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3183720.html
