华南海水养殖地区哈氏弧菌分子流行病学特征及其毒力菌株基因组分析

发布时间：2021-05-21 18:19

　　哈氏弧菌为华南沿海海水养殖地区常见的病原菌,对不同类型的海水养殖品种均造成了十分严重的危害。为了研究华南海水养殖地区哈氏弧菌的分子流行病学特征,探索哈氏弧菌致病机理,毒力基因分布情况、建立病原菌的快速检测方法、研究毒力菌株的耐药性以及基因组特征,为华南海水养殖地区的哈氏弧菌病害防治提供依据,本文开展了哈氏弧菌感染实验,分子分型以及特异性检测生物标记筛选、药敏实验、毒力菌株全基因组序列分析等实验,结果如下:1、成鱼养殖场分离的46株哈氏弧菌经RAPD及ERIC-PCR分型,均获得一类主要的遗传型菌株。其中,通过ERIC分型获得的18株菌株命名为ERIC-1型菌株。以1×107CFU/mL菌液浓度分别对斜带石斑鱼（Epinepheluscoioides）攻毒感染,结果所有18株ERIC-1型菌株在2-6 h内均致感染石斑鱼死亡,表明它们具有强毒性,均为毒力菌株。并且,该类菌株对斜带石斑鱼的致死时间均短于哈氏弧菌毒力菌株已有的相关报道,表明在我国南方海水养殖区域流行的水产动物哈氏弧菌病原具有相似的遗传背景,且很可能是一类有别于其他地区哈氏弧菌致病菌株的新的遗传型。2、以哈氏弧菌致病菌株GDH... 

【文章来源】：海南大学海南省 211工程院校

【文章页数】：134 页

【学位级别】：博士

【文章目录】：
摘要
Abstract
1 文献综述
    1.1 哈氏弧菌及其危害
        1.1.1 哈氏弧菌命名
        1.1.2 哈氏弧菌的主要特征
        1.1.3 哈氏弧菌引起的疾病
        1.1.4 哈氏弧菌致病机理
        1.1.5 哈氏弧菌的防治
    1.2 细菌分型及哈氏弧菌分型
        1.2.1 细菌分型的定义
        1.2.2 细菌分型方法
            1.2.2.1 表型分型方法
            1.2.2.2 分子分型方法
        1.2.3 哈氏弧菌分型
        1.2.4 毒力菌株生物标记筛选
    1.3 测序技术的发展
    1.4 哈氏弧菌全基因组测序
    1.5 本研究的目的意义
2 哈氏弧菌分型、致病菌筛选及菌落形态分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 实验仪器及试剂
        2.1.2 菌株
        2.1.3 石斑鱼
        2.1.4 细菌DNA提取
        2.1.5 RAPD引物筛选
        2.1.6 RAPD-PCR分型
        2.1.7 ERIC-PCR分型
        2.1.8 聚类分析
        2.1.9 致病菌确定
        2.1.10 致病菌菌落形态描述
    2.2 实验结果
        2.2.1 RAPD引物筛选
        2.2.2 RAPD分型
        2.2.3 ERIC-PCR分型
        2.2.4 毒性实验结果
        2.2.5 重分离菌株RAPD鉴定
        2.2.6 致病菌的菌落形态
    2.3 讨论
3 哈氏弧菌致病菌株的毒力基因PCR分析
    3.1 材料与方法
        3.1.1 细菌及引物
        3.1.2 毒力基因PCR分析
    3.2 结果
        3.2.1 致病菌株中毒力相关基因分布
        3.2.2 非致病菌株中毒力相关基因分布
    3.3 讨论
4 哈氏弧菌致病菌株PCR快速检测方法建立
    4.1 材料与方法
        4.1.1 菌株
        4.1.2 生物标记的确定
        4.1.3 引物设计筛选
        4.1.4 引物特异性验证
        4.1.5 引物灵敏度检测
        4.1.6 序列
    4.2 结果
        4.2.1 生物标记克隆测序
        4.2.2 引物设计
        4.2.3 引物特异性验证
        4.2.4 引物灵敏度检测
    4.3 讨论
5 哈氏弧菌致病菌株GDH11385毒力特征及致病机理研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 实验材料
        5.1.2 菌株GDH11385对水产动物的毒性
            5.1.2.1 对不同水产动物的毒性检测
            5.1.2.2 菌液的毒性来源检测
            5.1.2.3 对斜带石斑鱼的LD_(50)测定
            5.1.2.4 感染石斑鱼的组织病理学观察
            5.1.2.5 不同感染方式对感染效果的影响
        5.1.3 哈氏弧菌对小白鼠的毒性检测
            5.1.3.1 菌液制备
            5.1.3.2 腹腔注射感染
            5.1.3.3 病原确定
            5.1.3.4 感染患病小白鼠组织病理学检查
            5.1.3.5 对小白鼠的LD_(50)计算
    5.2 结果
        5.2.1 哈氏弧菌GDH11385对不同水产动物的毒性
            5.2.1.1 对多种水产动物感染结果
            5.2.1.2 菌悬液毒性来源检测结果
            5.2.1.3 对斜带石斑鱼的LD_(50)测定
            5.2.1.4 感染患病石斑鱼的组织病理检查
            5.2.1.5 不同感染方式对感染效果的影响
        5.2.2 哈氏弧菌对小白鼠的毒性检测结果
            5.2.2.1 哈氏弧菌对小白鼠的感染结果
            5.2.2.2 感染患病小白鼠组织病理检查
            5.2.2.3 菌株GDH11385对小白鼠的LD_(50)值测定
    5.3 讨论
6 石斑鱼育苗池弧菌调查及ERIC-1型菌株耐药性分析
    6.1 材料与方法
        6.1.1 实验材料
        6.1.2 细菌分离鉴定
        6.1.3 细菌毒性鉴定
        6.1.4 ERIC分子分型
        6.1.5 药敏实验
        6.1.6 数据统计
    6.2 结果
        6.2.1 细菌分离及感染结果
        6.2.2 ERIC-PCR分型
        6.2.3 药敏实验
    6.3 讨论
7 哈氏弧菌GDH11385菌株全基因序列测定及生物信息学分析
    7.1 材料与方法
        7.1.1 哈氏弧菌菌株
        7.1.2 哈氏弧菌的16s rDNA测序鉴定
        7.1.3 哈氏弧菌的基因组DNA提取及质控
        7.1.4 细菌全基因组测序
            7.1.4.1 测序流程
            7.1.4.2 Pacbio RS Ⅱ建库测序
            7.1.4.3 基因组序列的拼接组装
            7.1.4.4 基因组成份分析
        7.1.5 基因的预测及注释
            7.1.5.1 软件预测分析
            7.1.5.2 基因的功能分析
            7.1.5.3 RNA分析
        7.1.6 哈氏弧菌毒力基因分析
            7.1.6.1 毒力岛
            7.1.6.2 毒力因子
            7.1.6.3 水平转移基因分析
            7.1.6.4 分泌系统基因簇分析
        7.1.7 比较基因组分析
    7.2 结果
        7.2.1 哈氏弧菌基因组DNA的提取及质控
        7.2.2 哈氏弧菌系统给进化地位
        7.2.3 Pacbio RSII测序结果统计分析
            7.2.3.1 测序数据原始统计
            7.2.3.2 哈氏弧菌GDH11385全基因组拼接组装分析
            7.2.3.3 哈氏弧菌GDH11385基因预测与基因功能分析
            7.2.3.4 基因功能GO分类
            7.2.3.5 水平基因转移分析
            7.2.3.6 基因岛分析
            7.2.3.7 毒力基因
            7.2.3.8 细菌分泌系统
        7.2.4 哈氏弧菌GDH11385比较基因组分析
            7.2.4.1 哈氏弧菌比较
            7.2.4.2 与哈氏弧菌QT520全基因组比较分析
    7.3 讨论
全文总结
主要创新点
参考文献
附录
博士期间主要成果
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]以小鼠为模型的副溶血弧菌致病性影响因素比较[J]. 张德福,樊晓琳,付绪磊,赵悦彤,唐蜜,励建荣.  渤海大学学报(自然科学版). 2015(01)
[2]海水养殖鱼哈维弧菌分离株的耐药谱型分析[J]. 曾德乾,冯娟,徐力文,苏友禄,郭志勋.  中国水产科学. 2015(01)
[3]华南地区海水养殖鱼类主要弧菌病原的分离与鉴定[J]. 崔婧,范雪亭,刘文竹,李红月,周永灿,王世锋,谢珍玉.  海南大学学报(自然科学版). 2014(03)
[4]海南养殖方斑东风螺暴发性疾病病原分离鉴定及药敏分析[J]. 刘巧红,王世锋,蔡岩,张晗,谢珍玉,郭伟良,冯永勤,周永灿.  渔业科学进展. 2014(01)
[5]溶藻弧菌的毒力相关基因及其对小鼠的致病力[J]. 熊盼,彭喜春,魏霜,陈沿廷,赵晖,唐书泽,吴希阳.  微生物学报. 2014(01)
[6]我国南沙海域海水细菌学调查及药敏检测[J]. 张贞良,谢培增,贺顺龙,汪先兵.  解放军预防医学杂志. 2013(02)
[7]哈维氏弧菌的分子遗传多样性研究[J]. 徐芝亮,吴灶和,简纪常,黄郁葱.  水产学报. 2012(09)
[8]福建省鼠伤寒沙门菌分子流行病学研究[J]. 杨劲松,陈建辉,熊美琴,徐海滨,陈爱平.  中国预防医学杂志. 2012(03)
[9]石斑鱼类养殖技术体系的创建和石斑鱼养殖产业持续发展的思考[J]. 林浩然.  福建水产. 2012(01)
[10]褐点石斑鱼脱鳞病病原菌的分离与鉴定[J]. 徐先栋,谢珍玉,欧阳吉隆,王世锋,周永灿.  海洋科学. 2012(02)

博士论文
[1]哈氏弧菌种特异性分子标记的发现及其在哈氏弧菌快速诊断和免疫防治中的应用[D]. 孙鲲.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2009

硕士论文
[1]海水养殖鱼哈维弧菌分离株多位点序列分析及耐药谱型研究[D]. 曾德乾.上海海洋大学 2014
[2]华南地区鱼类病原哈维氏弧菌分型及其防治策略研究[D]. 崔婧.海南大学 2014
[3]湛江港网箱养殖海区水质因子与细菌数量的关系及弧菌属细菌的分布[D]. 邝英朋.广东海洋大学 2011
[4]牛结核病病原学调查及分子流行病学研究[D]. 杜艳芬.中国农业科学院 2009



本文编号：3200164