异育银鲫肿瘤坏死因子α蛋白的原核表达、纯化及促凋亡活性分析

发布时间：2021-05-22 23:08

　　为了实现异育银鲫Carassius auratus gibelio肿瘤坏死因子α（Tumor necrosis factor,TNF-α）在大肠杆菌表达系统的高效表达,并研究其在促鲫鱼细胞凋亡中的作用,采用PCR的方法从体质量（15±1） g异育银鲫脾脏组织中扩增TNF-α基因,构建pET28a-TNF-α重组质粒并转化至大肠杆菌BL21（DE3）中,经IPTG诱导表达后,通过Ni亲和层析柱纯化并采用尿素浓度梯度透析法进行蛋白复性,最后用rTNF-α蛋白处理鲫鱼鳍条细胞,通过Hoechst 33258染色法和荧光定量PCR技术,分析异育银鲫经rTNF-α蛋白处理后鲫鱼细胞的凋亡情况及凋亡相关基因Caspase 3和Caspase 8的表达变化。结果表明:诱导后获得了相对分子质量约为23 000的蛋白条带,且重组蛋白以包涵体形式存在;Western-blot显示,纯化产物与抗His单抗在相对分子量约23 000处出现了明显的反应条带,表明成功地实现了异育银鲫TNF-α的重组表达;进一步采用Hoechst 33258染色后发现,与正常细胞相比,经rTNF-α蛋白处理后的细胞核染色加深,呈碎... 

【文章来源】：大连海洋大学学报. 2020,35(02)北大核心CSCD

【文章页数】：6 页

【文章目录】：
1 材料与方法
    1.1 材料
    1.2 方法
        1.2.1 异育银鲫TNF-α基因的扩增
        1.2.2 重组表达质粒的构建
        1.2.3 异育银鲫TNF-α蛋白的表达分析
        1.2.4 重组TNF-α蛋白的纯化与复性
        1.2.5 Western-blot 采用湿法转印,将rTNF-α蛋白转移到NC膜上,并用1%
        1.2.6 Hoechst 33258染色
        1.2.7 荧光定量PCR
2 结果与分析
    2.1 重组表达载体的构建
    2.2 重组TNF-α蛋白的诱导表达
    2.3 重组TNF-α蛋白的纯化及鉴定
    2.4 Hoechst 33258染色结果
    2.5 凋亡相关基因的表达变化
3 讨论
    3.1 异育银鲫TNF-α的扩增及重组表达
    3.2 重组TNF-α蛋白能诱导鲫鱼细胞发生凋亡
4 结论


【参考文献】：
期刊论文
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硕士论文
[1]草鱼TNF-α和IFNγ2的克隆鉴定、重组表达及生物学功能的研究[D]. 陈丹燕.电子科技大学 2012



本文编号：3201816