SVCV糖蛋白在昆虫细胞中的表达及SVCV和IHNV抗体库的筛选

发布时间：2021-06-10 08:56

　　鲤春病毒血症（Spring viremia of carp, SVC）是一种由鲤春病毒血症病毒（Spring viremia of carp virus, SVCV）引起的严重的传染性急性流行病,主要影响鲤科鱼类。传染性造血器官坏死症（Infectious Hematopoietic Necrosis, IHN）是一种北半球鲑鱼科常见的传染性急性病毒病,由传染性造血器官坏死症病毒（Infectious Hematopoietic Necrosis Virus, IHNV）引起。SVCV和IHNV均属于弹状病毒科病毒。一旦发病,染病鱼类死亡率高达70%-90%,对世界水产养殖业造成巨大的经济损失。SVCV糖蛋白是SVCV最主要抗原,并携带病毒中和表位,糖蛋白基因是研制基因工程抗体的候选基因。本研究利用杆状病毒表达系统在昆虫细胞中成功的表达了SVCV G基因,对深入研究SVCV糖蛋白的生物学活性具有重要意义。噬菌体抗体技术具有操作简单,筛选周期短,并能获得高亲和力的特异性抗体等优点。因此,噬菌体抗体展示技术广泛的应用于抗体筛选。本实验利用杆状病毒表达系统表达SVCV糖蛋白。将SVCV糖蛋白... 

【文章来源】：华中农业大学湖北省 211工程院校 教育部直属院校

【文章页数】：67 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 文献综述
    1.1 鲤春病毒血症病毒
        1.1.1 SVCV的生物学特征
        1.1.2 SVCV基因组
        1.1.3 结构蛋白特征
        1.1.4 SVC流行特点及临床特征
    1.2 传染性造血器官坏死病病毒
        1.2.1 IHNV的生物学特征
        1.2.2 IHNV基因组
        1.2.3 结构蛋白特征
        1.2.4 IHN流行特点及临床特征
    1.3 杆状病毒表达系统
        1.3.1 杆状病毒的生物学特性
        1.3.2 杆状病毒表达系统的发展
    1.4 噬菌体展示技术概述
        1.4.1 噬菌体展示技术的概念
        1.4.2 噬菌体展示系统
        1.4.3 噬菌体抗体库的淘选方法
    1.5 研究目的与意义
第二章 SVCV糖蛋白在昆虫细胞中的表达与鉴定
    2.1 材料和方法
        2.1.1 毒株和细胞
        2.1.2 主要试剂和溶液配制
        2.1.3 引物
        2.1.4 实验仪器
        2.1.5 SVCV病毒的增殖及RNA提取
        2.1.6 糖蛋白基因的扩增
        2.1.7 质粒pFastBac-G的构建
        2.1.8 大肠杆菌DH10αBac感受态细胞的制备
        2.1.9 重组穿梭载体Bacmid-G的构建
        2.1.10 重组Bacmid-G的提取
        2.1.11 脂质体介导转染SF9细胞
        2.1.12 重组杆状病毒(AcNPV-G)的扩增及鉴定
        2.1.13 表达产物的SDS-PAGE电泳及Western-blot检测
        2.1.14 间接免疫荧光鉴定目的蛋白的表达
    2.2 结果与分析
        2.2.1 SVCV-G基因片段的扩增
        2.2.2 重组转移载体的双酶切鉴定
        2.2.3 穿梭载体Bacmid-G的构建
        2.2.4 重组杆状病毒的获得
        2.2.5 重组杆状病毒基因组PCR鉴定
        2.2.6 表达产物的SDS-PAGE及Western-blot检测
        2.2.7 间接免疫荧光鉴定目的蛋白的表达
    2.3 讨论
第三章 抗SVCV噬菌体单链抗体淘选及鉴定
    3.1 材料与方法
        3.1.1 主要实验材料
        3.1.2 主要试剂和溶液配制
        3.1.3 噬菌体文库扩增
        3.1.4 噬菌体展示文库的拯救
        3.1.5 抗SVCV单链抗体的淘选
        3.1.6 阳性克隆鉴定
        3.1.7 阳性克隆测序
        3.1.8 可溶性单链抗体的诱导表达
        3.1.9 单链抗体的Western blot分析
        3.1.10 可溶性单链抗体与SVCV结合性分析
        3.1.11 单链抗体的特异性分析
        3.1.12 亲和力常数测定
        3.1.13 间接免疫荧光试验
    3.2 结果与分析
        3.2.1 抗SVCV单链抗体库的淘选
        3.2.2 阳性克隆鉴定
        3.2.3 阳性克隆序列测定
        3.2.4 可溶性抗体的Western blot分析
        3.2.5 可溶性单链抗体与SVCV结合性分析
        3.2.6 特异性试验及亲和力常数
        3.2.7 免疫荧光试验
    3.3 讨论
第四章 抗IHNV噬菌体抗体库的淘选与鉴定
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 辅助噬菌体扩增
        4.1.3 辅助噬菌体滴度测定
        4.1.4 IHNV病毒纯化及提纯
        4.1.5 IHNV对抗体库的淘选
        4.1.6 阳性克隆鉴定
        4.1.7 阳性克隆测序
        4.1.8 可溶性抗体诱导表达及结合特性分析
        4.1.9 特异性分析
        4.1.10 抗体亲和力常数测定
        4.1.11 间接免疫荧光试验
    4.2 结果与分析
        4.2.1 抗IHNV噬菌体抗体的淘选
        4.2.2 阳性克隆鉴定
        4.2.3 阳性克隆测序
        4.2.4 可溶性单链抗体诱导表达
        4.2.5 可溶性单链抗体与IHNV结合性分析
        4.2.6 单链抗体特异性分析及亲和力常数测定
        4.2.7 间接免疫荧光试验
    4.3 讨论
参考文献
硕士期间发表的论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]噬菌体抗体库技术及其应用[J]. 吴懿娜,杜欣军,张伟伟,董峰,王硕.  细胞与分子免疫学杂志. 2010(04)
[2]鱼类传染性造血组织坏死病（IHN）的病毒学特征和流行病学特点[J]. 王光玉,陈雷,曲径,徐仲,马放.  水产科学. 2007(05)
[3]鱼类弹状病毒分子生物学研究动态[J]. 阮红梅,张奇亚.  中国水产科学. 2003(06)
[4]噬菌体展示技术的原理和方法[J]. 戴和平,高宏,赵新颜.  水生生物学报. 2002(04)
[5]噬菌体抗体库几种筛选方法的比较[J]. 王刚,刘玉峰,王琰,化冰.  第四军医大学学报. 2001(16)
[6]鱼类病毒病与鱼类病毒疫苗[J]. 吴金炉,曾志南.  海洋科学. 1999(04)
[7]中国本溪虹鳟一株弹状病毒的分离及初步研究[J]. 赵志壮,牛鲁祺.  水生生物学报. 1994(04)
[8]东北地区虹鳟IHN和IPN流行病学的初步研究[J]. 牛鲁祺,赵志壮.  水产学报. 1988(04)

博士论文
[1]家蚕核多角体病毒（BmNPV）orf126基因的功能研究[D]. 郝碧芳.西北农林科技大学 2008



本文编号：3222081