鲤春病毒血症病毒G蛋白的原核表达及其单克隆抗体的制备
发布时间：2021-06-14 23:21
鲤春病毒血症（Spring Viraemia of Carp, SVC）是一种鲤科鱼类的急性、出血性的传染病，可引发多种鲤科鱼类感染，造成巨大的经济损失。鲤春病毒血症病毒（SVCV）囊膜上具有G蛋白，是病毒最主要的抗原表位，同时也与病毒内吞密切相关。单克隆抗体（MonoclonalAntibody，mAb）是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，具有特异性强、灵敏度高，能够大量制备的特点，在病毒的检测方面具有广阔的应用前景，OIE推荐的SVCV检测方法是建立在单克隆抗体基础。本文重组表达鲤春病毒G蛋白片段，并制备其特异性单克隆抗体。与全病毒抗原相比，以G蛋白为抗原制备的单克隆抗体有显著地优势，可简化准备流程、提高阳性率、缩短制备周期。目前尚无以重组SVCV-G蛋白制备单克隆抗体的先例。主要结果和结论如下：1、G蛋白的表达与纯化。本章扩增了SVCV G基因片段（63-1389bp），构建pET-28a-G重组表达质粒，实现了G蛋白在大肠杆菌中高效表达，表达产物以包涵体形式存在。这与张琳等的结果相符。通过变性、洗涤纯化，获得较纯的变性蛋白，经过透析复性后，达到免疫用...
【文章来源】：大连海洋大学辽宁省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
鲤春病毒血症病毒Fig.1-1SpringViremiaofCarp
介于 76～88kDa 之间[29]。其。Roche S 等[30]通过晶体衍镶嵌在病毒囊膜表面，存在化和 N-糖基化，O-糖基化位白结构，可见 G 蛋白折叠成性地结合宿主胞外受体，研制鲤春病毒基因工程疫苗[34]按照 G 基因核酸序列以亚型，其中Ⅰa、Ⅰd 变异度 蛋白的基因序列存在差异。时发生突变，病毒毒力将明的依据。
丽春红溶液预染后剪成条带，用 PBS 清洗； PVDF 膜置于 1% BSA 封闭，浸于 0.01mol/L 的 PBST 缓冲液，每次 5m于抗 His 单抗（1:1000 稀释）中，37℃孵育 1h，浸于 0.01mol/L 的 PBS次 5min/3 次；加入碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠 IgG（1:3000 稀释）育 45min。浸于 0.01mol/L 的 PBST 缓冲液，每次 5min/3 次； PVDF 膜置于 NBT/BCIP 显色液中，暗处反应 15min，碱性磷酸酶缓0min，加入 ddH2O 终止反应，暗处保存。果春病毒的增殖与鉴定 细胞长成单层后进行染毒，同时设未接种的正常细胞作对照（图 2-1，镜下观察感染细胞病理变化（CPE），16h 后开始出现空洞（图 2-1，b），最为明显（图 2-1，c），表现为 EPC 细胞圆缩，胞质空泡化。收集病毒悬品，电镜下观察到病毒呈子弹状（图 2-1，d）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲤春病毒血症病毒新型液相芯片检测技术的建立[J]. 尹伟力,方绍庆,刘宁,岳志芹,刘荭,耿金培,许红岩. 中国兽医学报. 2013(12)
[2]真鲷虹彩病毒辽宁株跨膜蛋白（ORF049L）基因的克隆及表达[J]. 孙志鹏,徐祥,李强,叶仕根,李华. 大连海洋大学学报. 2013(02)
[3]猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展[J]. 张月,兰邹然,王贵升,孙圣福. 中国畜禽种业. 2012(10)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 杨振慧,葛均青,刘荭,杨金先,郑晓聪,林天龙. 福建农林大学学报(自然科学版). 2011(06)
[6]中国鲤鱼春季病毒血症毒株糖蛋白基因的亚克隆表达与纯化[J]. 张琳,丁雅苓,陈建民,夏春. 中国兽医杂志. 2011(07)
[7]猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 张志榜,陈建飞,时洪艳,杨斌,石达,陈小金,冯力. 中国预防兽医学报. 2011(07)
[8]毕赤酵母蛋白表达系统研究进展[J]. 杨梅,温真,林丽玉,杨彩云. 生物技术通报. 2011(04)
[9]鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]. 张朋,刘荭,陈孝煊,吴志新,余剑敏,杜娟,兰文升,史秀杰,郑晓聪,何俊强,贾鹏,申斯思,朱家增. 中国预防兽医学报. 2011(04)
[10]一种水产动物病毒现场检测免疫芯片的制备与应用[J]. 徐晓丽,绳秀珍,战文斌. 海洋与湖沼. 2010(05)
博士论文
[1]对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选[D]. 王轶南.中国海洋大学 2008
[2]牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的研制及其在牙鲆淋巴囊肿病研究中的应用[D]. 李强.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]鲤春病毒血症病毒外膜蛋白G和基质蛋白M的原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 杨振慧.福建师范大学 2011
[2]中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备、特性分析及应用研究[D]. 朱春华.福建农林大学 2008
本文编号：3230422
【文章来源】：大连海洋大学辽宁省
【文章页数】：50 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
鲤春病毒血症病毒Fig.1-1SpringViremiaofCarp
介于 76～88kDa 之间[29]。其。Roche S 等[30]通过晶体衍镶嵌在病毒囊膜表面，存在化和 N-糖基化，O-糖基化位白结构，可见 G 蛋白折叠成性地结合宿主胞外受体，研制鲤春病毒基因工程疫苗[34]按照 G 基因核酸序列以亚型，其中Ⅰa、Ⅰd 变异度 蛋白的基因序列存在差异。时发生突变，病毒毒力将明的依据。
丽春红溶液预染后剪成条带，用 PBS 清洗； PVDF 膜置于 1% BSA 封闭，浸于 0.01mol/L 的 PBST 缓冲液，每次 5m于抗 His 单抗（1:1000 稀释）中，37℃孵育 1h，浸于 0.01mol/L 的 PBS次 5min/3 次；加入碱性磷酸酶（AP）标记的羊抗鼠 IgG（1:3000 稀释）育 45min。浸于 0.01mol/L 的 PBST 缓冲液，每次 5min/3 次； PVDF 膜置于 NBT/BCIP 显色液中，暗处反应 15min，碱性磷酸酶缓0min，加入 ddH2O 终止反应，暗处保存。果春病毒的增殖与鉴定 细胞长成单层后进行染毒，同时设未接种的正常细胞作对照（图 2-1，镜下观察感染细胞病理变化（CPE），16h 后开始出现空洞（图 2-1，b），最为明显（图 2-1，c），表现为 EPC 细胞圆缩，胞质空泡化。收集病毒悬品，电镜下观察到病毒呈子弹状（图 2-1，d）。
【参考文献】：
期刊论文
[1]鲤春病毒血症病毒新型液相芯片检测技术的建立[J]. 尹伟力,方绍庆,刘宁,岳志芹,刘荭,耿金培,许红岩. 中国兽医学报. 2013(12)
[2]真鲷虹彩病毒辽宁株跨膜蛋白（ORF049L）基因的克隆及表达[J]. 孙志鹏,徐祥,李强,叶仕根,李华. 大连海洋大学学报. 2013(02)
[3]猪瘟病毒基因组蛋白结构及蛋白表达技术的研究进展[J]. 张月,兰邹然,王贵升,孙圣福. 中国畜禽种业. 2012(10)
[4]重组蛋白表达系统的研究进展[J]. 范翠英,冯利兴,樊金玲,果德安,刘璇. 生物技术. 2012(02)
[5]鲤春病毒血症病毒基质蛋白基因的原核表达及多克隆抗体的制备[J]. 杨振慧,葛均青,刘荭,杨金先,郑晓聪,林天龙. 福建农林大学学报(自然科学版). 2011(06)
[6]中国鲤鱼春季病毒血症毒株糖蛋白基因的亚克隆表达与纯化[J]. 张琳,丁雅苓,陈建民,夏春. 中国兽医杂志. 2011(07)
[7]猪流行性腹泻病毒M蛋白单克隆抗体的制备及鉴定[J]. 张志榜,陈建飞,时洪艳,杨斌,石达,陈小金,冯力. 中国预防兽医学报. 2011(07)
[8]毕赤酵母蛋白表达系统研究进展[J]. 杨梅,温真,林丽玉,杨彩云. 生物技术通报. 2011(04)
[9]鲤春病毒血症病毒单克隆抗体的制备及其特性鉴定[J]. 张朋,刘荭,陈孝煊,吴志新,余剑敏,杜娟,兰文升,史秀杰,郑晓聪,何俊强,贾鹏,申斯思,朱家增. 中国预防兽医学报. 2011(04)
[10]一种水产动物病毒现场检测免疫芯片的制备与应用[J]. 徐晓丽,绳秀珍,战文斌. 海洋与湖沼. 2010(05)
博士论文
[1]对虾白斑症病毒囊膜蛋白单克隆抗体的研制及中和抗体筛选[D]. 王轶南.中国海洋大学 2008
[2]牙鲆免疫球蛋白单克隆抗体的研制及其在牙鲆淋巴囊肿病研究中的应用[D]. 李强.中国海洋大学 2007
硕士论文
[1]鲤春病毒血症病毒外膜蛋白G和基质蛋白M的原核表达及多克隆抗体的制备[D]. 杨振慧.福建师范大学 2011
[2]中华鳖虹彩病毒单克隆抗体的制备、特性分析及应用研究[D]. 朱春华.福建农林大学 2008
本文编号：3230422
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