激活诱导胞嘧啶脱氨酶基因在斑马鱼中的功能研究
发布时间：2021-06-16 22:30
有颌类脊椎动物中出现的基于淋巴细胞的适应性免疫系统是免疫系统进化的一个里程碑,它能够针对特异的抗原,辨别自我和非我,并且能够形成免疫记忆。B细胞以及其表达的免疫球蛋白是适应性免疫系统的重要组成部分,而在免疫球蛋白基因表达过程中,激活诱导胞嘧啶脱氨酶（activation-induced cytidine deaminase, AID）是一个非常重要的蛋白因子。AID能够导致DNA中的胞嘧啶脱去氨基,转化为尿嘧啶。在后续的修复过程中,AID能够引发体细胞超突变（SHM）、基因转换（GC）和类别转换重组（CSR）等过程,这些过程能够改变B细胞表达的免疫球蛋白的可变区和恒定区,极大地丰富了免疫球蛋白可变区的多样性和恒定区的效应作用。在脊椎动物免疫系统的进化过程中,参与免疫球蛋白基因表达的上述特殊机制如体细胞超突变和类别转换重组并不是同时出现的。在低等的脊椎动物鱼类中,免疫球蛋白基因体细胞超突变发生频率非常低,而类别转换重组过程则没有被发现。为了研究脊椎动物早期进化过程中这些机制的作用,在本论文的研究中我们构建了Aicda基因敲除的斑马鱼。我们以Tubingen斑马鱼品系为材料,利用TALEN...
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
英文縮略词表
第一章 综述
1.1 免疫球蛋白的分子结构
1.1.1 免疫球蛋白种类
1.1.2 免疫球蛋白的基本结构
1.1.3 免疫球蛋白的基因结构
1.2 免疫球蛋白多样性的产生机制
1.2.1 免疫球蛋白可变区多样性产生机制
1.2.2 免疫球蛋白的恒定区的转换
1.2.3 激活诱导胞嘧啶脱氨酶
1.3 免疫球蛋白基因及其表达机制的进化
1.3.1 免疫球蛋白重链基因的进化
1.3.2 免疫球蛋白表达机制的进化
1.4 硬骨鱼类的免疫系统
1.4.1 硬骨鱼类免疫球蛋白的种类
1.4.2 硬骨鱼类免疫球蛋白重链基因结构
1.4.3 硬骨鱼类免疫球蛋白的表达机制
1.5 斑马鱼模型
1.5.1 斑马鱼
1.5.2 斑马鱼在免疫系统研究中的应用
1.6 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验样本
2.1.2 质粒和菌株
2.1.3 分子生物学实验试剂及试剂盒
2.1.4 主要试剂配制
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 TALEN构建
2.3.2 mRNA体外转录
2.3.3 斑马鱼卵的收集
2.3.4 显微注射
2.3.5 DNA提取
2.3.6 RNA提取
2.3.7 反转录方法
2.3.8 常用PCR体系和条件
2.3.9 T-A克隆
2.3.10 定量RT-PCR实验方法
2.3.11 斑马鱼血液涂片制作及白细胞计数
2.3.12 斑马鱼的免疫
2.3.13 斑马鱼血清制备
2.3.14 斑马鱼血清总蛋白含量测定
2.3.15 ELISA法检测斑马鱼卵中特异抗体滴度
2.3.16 嗜水气单胞杆菌培养和收集
2.3.17 嗜水气单胞杆菌OD-CFU曲线测定
2.3.18 嗜水气单胞杆菌浸染斑马鱼
2.3.19 5’RACE实验方法
2.3.20 鳗弧菌的培养和收集
2.3.21 鳗弧菌免疫和攻毒
2.4 主要数据库及分析软件
第三章 结果与分析
3.1 突变斑马鱼的Aicda基因
3.1.1 验证斑马鱼Aicda基因组序列信息
3.1.2 利用锌指酶技术突变斑马鱼的Aicda基因
3.1.3 利用TALEN技术突变斑马鱼的Aicda基因
3.2 Aicda基因突变斑马鱼品系的建立
3.2.1 筛选Aicda基因突变的嵌合体F_0代斑马鱼
3.2.2 筛选Aicda基因突变的杂合体F_1代斑马鱼
3.2.3 筛选和鉴定Aicda基因突变的纯合体F_2代斑马鱼
3.3 斑马鱼主要免疫球蛋白的表达
3.3.1 μ基因在斑马鱼的不同器官中的表达
3.3.2 ζ基因在斑马鱼的不同器官中的表达分析
3.3.3 斑马鱼不同发育时期Aicda基因的表达
3.3.4 斑马鱼不同发育时期μ基因的表达
3.3.5 斑马鱼不同发育时期ζ基因的表达
3.4 基因组水平检测J_H下游内含子区域的体细胞超突变的发生
3.4.1 高保真酶的选择
3.4.2 J_H内含子扩增引物设计
3.4.3 体细胞超突变分析
3.4.4 J_H内含子上游CDR3区域的N-P核苷酸分析
3.5 TNP-BSA免疫后斑马鱼的免疫球蛋白可变区分析
3.5.1 TNP-BSA免疫斑马鱼
3.5.2 构建斑马鱼IgM的可变区cDNA文库
3.5.3 CDR3统计分析
3.5.4 V_H基因家族使用情况分析
3.5.5 JH基因片段使用情况分析
3.6 ELISA检测TNP-BSA免疫后血清中特异抗体滴度
3.6.1 TNP-BSA免疫斑马鱼、获取斑马鱼血清以及血清总蛋白浓度测定
3.6.2 ELISA检测斑马鱼中特异抗体的含量
3.7 ELISA检测斑马鱼血清中的IgM和IgZ含量
3.7.1 斑马鱼血清的获取和浓度测定
3.7.2 ELISA检测斑马鱼血清中IgM和IgZ的含量
3.8 斑马鱼主要组织器官观察
3.9 嗜水气单胞杆菌浸染斑马鱼
3.9.1 嗜水气单胞杆菌OD-CFU曲线
3.9.2 嗜水气单胞杆菌攻毒实验
3.9.3 死亡斑马鱼体征
3.9.4 死亡斑马鱼内脏团检测
3.9.5 死亡斑马鱼内脏团嗜水气单胞杆菌的分离
3.9.6 存活斑马鱼基因组中嗜水气单胞杆菌含量
3.10 鳗弧菌侵染斑马鱼
3.10.1 制弱鳗弧菌疫苗免疫斑马鱼
3.10.2 致病株鳗弧菌侵染未免疫的斑马鱼
3.10.3 致病株鳗弧菌侵染免疫后的斑马鱼
3.10.4 ELISA检测免疫后斑马鱼血清中鳗弧菌特异抗体的滴度
3.11 斑马鱼IgM和IgZ类别转换重组研究
3.11.1 设计类别转换重组检测引物
3.11.2 巢式PCR扩增J_ζ-C_μ1拼接产物
3.12 讨论与展望
第四章 结论
参考文献
附录
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究[J]. 何夙旭,张美超,徐俐,杨雅麟,李青,周志刚. 水产学报. 2013(01)
本文编号：3233913
【文章来源】：中国农业大学北京市 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
目录
英文縮略词表
第一章 综述
1.1 免疫球蛋白的分子结构
1.1.1 免疫球蛋白种类
1.1.2 免疫球蛋白的基本结构
1.1.3 免疫球蛋白的基因结构
1.2 免疫球蛋白多样性的产生机制
1.2.1 免疫球蛋白可变区多样性产生机制
1.2.2 免疫球蛋白的恒定区的转换
1.2.3 激活诱导胞嘧啶脱氨酶
1.3 免疫球蛋白基因及其表达机制的进化
1.3.1 免疫球蛋白重链基因的进化
1.3.2 免疫球蛋白表达机制的进化
1.4 硬骨鱼类的免疫系统
1.4.1 硬骨鱼类免疫球蛋白的种类
1.4.2 硬骨鱼类免疫球蛋白重链基因结构
1.4.3 硬骨鱼类免疫球蛋白的表达机制
1.5 斑马鱼模型
1.5.1 斑马鱼
1.5.2 斑马鱼在免疫系统研究中的应用
1.6 本研究的目的和意义
第二章 材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 实验样本
2.1.2 质粒和菌株
2.1.3 分子生物学实验试剂及试剂盒
2.1.4 主要试剂配制
2.2 实验仪器
2.3 实验方法
2.3.1 TALEN构建
2.3.2 mRNA体外转录
2.3.3 斑马鱼卵的收集
2.3.4 显微注射
2.3.5 DNA提取
2.3.6 RNA提取
2.3.7 反转录方法
2.3.8 常用PCR体系和条件
2.3.9 T-A克隆
2.3.10 定量RT-PCR实验方法
2.3.11 斑马鱼血液涂片制作及白细胞计数
2.3.12 斑马鱼的免疫
2.3.13 斑马鱼血清制备
2.3.14 斑马鱼血清总蛋白含量测定
2.3.15 ELISA法检测斑马鱼卵中特异抗体滴度
2.3.16 嗜水气单胞杆菌培养和收集
2.3.17 嗜水气单胞杆菌OD-CFU曲线测定
2.3.18 嗜水气单胞杆菌浸染斑马鱼
2.3.19 5’RACE实验方法
2.3.20 鳗弧菌的培养和收集
2.3.21 鳗弧菌免疫和攻毒
2.4 主要数据库及分析软件
第三章 结果与分析
3.1 突变斑马鱼的Aicda基因
3.1.1 验证斑马鱼Aicda基因组序列信息
3.1.2 利用锌指酶技术突变斑马鱼的Aicda基因
3.1.3 利用TALEN技术突变斑马鱼的Aicda基因
3.2 Aicda基因突变斑马鱼品系的建立
3.2.1 筛选Aicda基因突变的嵌合体F_0代斑马鱼
3.2.2 筛选Aicda基因突变的杂合体F_1代斑马鱼
3.2.3 筛选和鉴定Aicda基因突变的纯合体F_2代斑马鱼
3.3 斑马鱼主要免疫球蛋白的表达
3.3.1 μ基因在斑马鱼的不同器官中的表达
3.3.2 ζ基因在斑马鱼的不同器官中的表达分析
3.3.3 斑马鱼不同发育时期Aicda基因的表达
3.3.4 斑马鱼不同发育时期μ基因的表达
3.3.5 斑马鱼不同发育时期ζ基因的表达
3.4 基因组水平检测J_H下游内含子区域的体细胞超突变的发生
3.4.1 高保真酶的选择
3.4.2 J_H内含子扩增引物设计
3.4.3 体细胞超突变分析
3.4.4 J_H内含子上游CDR3区域的N-P核苷酸分析
3.5 TNP-BSA免疫后斑马鱼的免疫球蛋白可变区分析
3.5.1 TNP-BSA免疫斑马鱼
3.5.2 构建斑马鱼IgM的可变区cDNA文库
3.5.3 CDR3统计分析
3.5.4 V_H基因家族使用情况分析
3.5.5 JH基因片段使用情况分析
3.6 ELISA检测TNP-BSA免疫后血清中特异抗体滴度
3.6.1 TNP-BSA免疫斑马鱼、获取斑马鱼血清以及血清总蛋白浓度测定
3.6.2 ELISA检测斑马鱼中特异抗体的含量
3.7 ELISA检测斑马鱼血清中的IgM和IgZ含量
3.7.1 斑马鱼血清的获取和浓度测定
3.7.2 ELISA检测斑马鱼血清中IgM和IgZ的含量
3.8 斑马鱼主要组织器官观察
3.9 嗜水气单胞杆菌浸染斑马鱼
3.9.1 嗜水气单胞杆菌OD-CFU曲线
3.9.2 嗜水气单胞杆菌攻毒实验
3.9.3 死亡斑马鱼体征
3.9.4 死亡斑马鱼内脏团检测
3.9.5 死亡斑马鱼内脏团嗜水气单胞杆菌的分离
3.9.6 存活斑马鱼基因组中嗜水气单胞杆菌含量
3.10 鳗弧菌侵染斑马鱼
3.10.1 制弱鳗弧菌疫苗免疫斑马鱼
3.10.2 致病株鳗弧菌侵染未免疫的斑马鱼
3.10.3 致病株鳗弧菌侵染免疫后的斑马鱼
3.10.4 ELISA检测免疫后斑马鱼血清中鳗弧菌特异抗体的滴度
3.11 斑马鱼IgM和IgZ类别转换重组研究
3.11.1 设计类别转换重组检测引物
3.11.2 巢式PCR扩增J_ζ-C_μ1拼接产物
3.12 讨论与展望
第四章 结论
参考文献
附录
致谢
个人简历
【参考文献】：
期刊论文
[1]高丝氨酸内酯酶AI-96对嗜水气单胞菌NJ-1浸浴攻毒斑马鱼保护效应的研究[J]. 何夙旭,张美超,徐俐,杨雅麟,李青,周志刚. 水产学报. 2013(01)
本文编号：3233913
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/scyylw/3233913.html
