海豚链球菌荚膜相关基因cpsJ敲除突变株构建及其生物学特性研究

发布时间：2021-06-20 17:24

　　海豚链球菌（Streptococcus iniae, S.iniae曾用名Streptococcus shiloi）是一种重要的水产养殖鱼类病原菌,近年来由海豚链球菌感染导致的鱼类疾病暴发频见报端,为全球水产养殖业带来巨大的经济损失。荚膜是海豚链球菌重要的毒力因子,由多种多糖成分组成。海豚链球菌荚膜合成的操纵子由21个开放阅读框构成。cpsJ是荚膜合成操纵子中一个重要的基因,它编码一个尿苷二磷酸葡萄糖（UDP-Glc）差向异构酶,参与构成荚膜的杂多糖的前体合成。本文利用温敏载体质粒pJRS233对cpsJ基因进行敲除,通过同源重组将cpsJ基因置换为氯霉素抗性基因,构建基因敲除突变株ΔcpsJ。然后分别对ΔcpsJ和野生型海豚链球菌进行革兰氏染色并镜检、菌落观察、生长率测定、粘附入侵试验、全血杀灭试验和攻毒试验,对cpsJ的功能进行初步研究。结果显示突变株ΔcpsJ与野生型相比,在同等培养条件下,菌体形成的链长更长；同等培养条件下在THY平板上形成的菌落外观一致但直径更小；在生长率测定试验中,突变株的生长曲线到达平台期时菌液OD600值为0.42,野生型为1.28；在粘附与入侵试验中,... 

【文章来源】：四川农业大学四川省 211工程院校

【文章页数】：63 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
文献综述
    1. 海豚链球菌研究进展
        1.1 海豚链球菌来源及血清分型
        1.2 鱼类海豚链球菌病的流行情况
        1.3 海豚链球菌的感染性
        1.4 海豚链球菌的致病机制
        1.5 海豚链球菌的毒力因子
        1.6 海豚链球菌的防控
    2. 海豚链球菌荚膜的研究进展
        2.1 细菌荚膜概况
        2.2 细菌荚膜的作用及致病机制
        2.3 海豚链球菌荚膜
    3. 研究目的与意义
第一章 cpsJ基因缺失株的构建
    1. 材料
        1.1 载体
        1.2 菌株
        1.3 主要试剂
        1.4 主要试剂及配制
        1.5 主要仪器
    2 方法
        2.1 引物设计
        2.2 海豚链球菌的培养及基因组DNA的提取
        2.3 从琼脂糖凝胶中回收纯化DNA片段(胶回收)
        2.4 基因敲除目的片段的扩增
        2.5 感受态DH5α大肠杆菌的制备(CaCl_2法)
        2.6 感受态DGX07海豚链球菌的制备
        2.7 敲除重组载体的构建
        2.8 电转化
        2.9 敲除突变株的筛选
    3. 结果
        3.1 基因敲除目的片段和敲除载体pJRS233-ΔcpsJ的合成和鉴定
        3.2 敲除突变株的筛选和鉴定
    4. 讨论
        4.1 利用同源重组进行基因敲除的原理
        4.2 利用温敏穿梭载体质粒pJRS233进行基因敲除
        4.3 突变株PCR鉴定
第二章 cpsJ基因敲除突变株的生物学特性研究
    1 材料
        1.1 菌株
        1.2 试剂
        1.3 仪器
        1.4 实验动物
        1.5 主要试剂配制方法
    2. 方法
        2.1 菌体菌落形态观察
        2.2 生长率分析
        2.3 全血存活试验
        2.4 粘附与入侵试验
        2.5 攻毒试验
    3. 结果
        3.1 菌体菌落形态观察结果
        3.2 生长率测定结果
        3.3 粘附和入侵试验结果
        3.4 全血杀灭试验结果
        3.5 攻毒试验结果
    4. 讨论
        4.1 ⊿cpsJ突变株形成长链的讨论
        4.2 ⊿cpsJ突变株具有较高的粘附和入侵性的讨论
        4.3 ⊿cpsJ具有较低生长率的讨论
结论
参考文献
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]细菌荚膜多糖[J]. 王楷宬,陆承平,范伟兴.  微生物学报. 2011(12)
[2]广西罗非鱼海豚链球菌的分离鉴定[J]. 邓显文,谢芝勋,谢志勤,刘加波,庞耀珊,谢丽基.  广西农业科学. 2010(05)
[3]鲤鱼上皮瘤细胞和草鱼性腺细胞冻存效果的比较[J]. 朱霞,迟源,王好,周井祥.  中国生物制品学杂志. 2010(04)
[4]猪链球菌2型的粘附作用机制研究进展[J]. 李伟,徐建国.  中国媒介生物学及控制杂志. 2008(04)
[5]斑点叉尾鮰暴发性海豚链球菌病的研究[J]. 余晓丽,陈明,李超,李莉萍,雷爱莹,钟穆妮,梁万文.  大连水产学院学报. 2008(03)
[6]养殖鱼类链球菌病病原的分离鉴定及其16S rDNA分析[J]. 周素明,李安兴,马跃,刘瑞明.  中山大学学报(自然科学版). 2007(02)
[7]红拟石首鱼海豚链球菌分离、鉴定及致病性研究[J]. 沈智华,钱冬,许文军,顾金华,邵健忠.  水生生物学报. 2005(06)

博士论文
[1]一株海豚链球菌的分离鉴定及其亚单位疫苗研究[D]. 程爽.中国科学院研究生院（海洋研究所） 2010



本文编号：3239620